王婧 阴赤贞宏 郭增柱
【关键词】 肺孢子虫； 肺炎
肺孢子虫肺炎（pneumocystis pneumonia，PCP）是一种发生于免疫功能低下患者的肺孢子虫严重肺部机会性感染。肺孢子虫可以称为一种威胁人类健康的“机会致病型”寄生虫。由于最近数十年来广泛应用免疫抑制剂以及对恶性肿瘤患者进行化疗，PCP较过去多见。尤其自1989年获得性免疫缺陷综合征（acquired immuno deficiency syndrome,AIDS）出现后，PCP更受到广泛关注，与其相关研究也成为一个热点，现将PCP研究进展综述如下。
1 病原学
肺孢子虫过去被认为属于原虫，1988年Edman等[1]根据其超微结构和对肺孢子虫核糖体RNA种系发育分析认为肺孢子虫属于真菌类。肺孢子虫有耶氏肺孢子虫(PJ)、卡氏肺孢子虫（PC）、卫氏肺孢子虫（PW）等不同种类，寄生于不同哺乳动物肺内，引起PCP，其中PJ主要寄生在人体内，PC则以大鼠为宿主，PJ和PC的18S RNA序列差异达5%，由此推测不同宿主的肺孢子虫DNA序列有差异，且具有宿主种特异性[2]。但最近有报道称，肺孢子虫的不同种属可同时寄居在哺乳动物肺内，如PC和PW间存在着竞争与共存的关系[3]。在历时6年多的观察中发现，肺孢子虫在繁殖到460代时，呈现稳定的共存关系，聚合酶链反应(PCR)和荧光免疫检验法证明二者可以共存。繁殖700余代时，经过Lotka Volterra竞争模型分析，结果提示两种种属间有竞争关系，并预示着其中一种将会排斥掉另外一种。Logistic回归显示，较大湿度和肺部负担有助于PC的生长，较低温度和逐渐增加的鼠群密度与PW的感染有关。因此，二者竞争和共存的关系受到外界因素的影响。
2 流行病学
肺孢子虫广泛存在于人和其他哺乳动物的肺组织内，大多数正常人都曾有过肺孢子虫感染，只不过健康人感染肺孢子虫后多数为隐性感染，无症状。只有当宿主免疫功能低下时，侵入人体的肺孢子虫才开始进行大量繁殖，并在肺组织内扩散，导致间质性浆细胞性肺炎。这时，肺组织的泡沫状渗出物为肺泡内蛋白性渗出伴脱落变性的肺泡细胞，少量为巨噬细胞、滋养体和包囊等。
2.1 传染源：PCP患者是重要的传染源。患者的肺组织、支气管和气管分泌物内含有大量肺孢子虫包囊，包囊随患者痰液咳出后，污染空气而感染周围人群。由于虫株具有很强的宿主种特异性，故动物宿主作为传染源的意义不大。
2.2 传播途径：肺孢子虫的传播途径尚未完全明了。推测可由人与人之间的飞沫传播引起。极少数情况下也可能存在胎盘传播。
2.3 易感人群：任何年龄的人群均可感染肺孢子虫，但免疫功能正常的人感染后并不发病。PCP主要见于早产婴儿和新生儿、先天性免疫功能缺陷或继发性免疫功能低下患儿、恶性肿瘤如白血病患者、器官移植接受免疫抑制剂治疗患儿、AIDS患者。
3 发病机制与基因相关性
根据动物模型及患者观察证明，PCP发生与T淋巴细胞免疫功能低下关系非常密切。目前国外认为，凡CD4（辅助性T细胞）计数≤2×10 5/L时，发生PCP危险甚大，但此标准对小儿尤其是1岁以内者不适用。
寄生虫在体内寄生时，为了能够在肺内较长时间生存，其表面抗原通常有多变性，以躲避机体免疫系统的攻击，肺孢子虫也不例外。Keely等[3]研究发现，肺孢子虫的抗原多变性至少与主要表面糖蛋白(major surface glycoprotein，MSG)、相关MSG(MSG related，MSR)以及蛋白酶(protease，PRT1)的3个基因家族有关，这些基因集簇聚集在染色体末端，编码微生物表面蛋白。
MSG存在于肺孢子虫细胞表面，含量丰富，主要控制表面抗原变异。在给定的时间内，只有大约1/80的开放读码框架(ORF)能够编码不同的MSG亚型。MSG的ORF位于基因组上的特异位点，编码上游保守序列(UCS：编码引导MSG至表面的信号肽)。5′末端编码不同的MSG蛋白，UCS可被大量MSG基因复制。在UCS与MSG的ORF之间，有25 bp的固定序列（固定基因重组连接片段CRJE，在重组时用来表达位点上安装ORF）。CRJE还可以出现在非UCS连接的MSG ORF。
MSR基因与MSG ORF非常相似，但其表达不依赖于UCS，没有CRJE，可以被特异内含子中断。根据长度不同，MSR基因分为两类：长MSR基因，长度与MSR相似(约3 kb)；短MSR基因，比前者缺少1 kb片段。MSR基因表达没有明显特点，但它是原位翻译，而不是转移到特殊表达位点。机体内MSR基因数量尚不清楚，在一个肺孢子虫群体（80%的有机体在表达位点上含有相同的MSG基因）中观察到13个MSR基因被转录，MSR蛋白存在于细胞表面。
PRT1基因在结构和序列上不同于MSG和MSR，含有很多内含子，其表达也没完全清楚。但有研究证明，PRT1蛋白存在于细胞表面，在特定时间体内可以有多重PRT1基因表达。肺孢子虫基因组有34个端粒，每一个都有表面抗原基因集簇，端粒上的MSG、MSR和PRT1基因集簇已经明确，但仍有很多问题有待进一步研究。
Crothers等[4]用前瞻性研究方法对人类免疫缺陷病毒(HIV)合并PCP患者进行研究发现，感染二氢蝶呤酯合酶(dihydropteroate synthase，DHPS)基因突变肺孢子虫患者60 d存活率为86%，更需要机械通气，病死率也高于野生型(14.3%比2.5%；14.3%比7.5%)。亦有报道称DHPS基因突变与磺胺类药物的抗药性有关[5]。
表面活化蛋白A(surfactant protein A，SP-A)和 SP-D在肺部宿主防御中起着重要作用，它们可以绑定肺孢子虫并调整肺泡巨噬细胞对肺孢子虫的作用。研究显示[6]：对SP-A基因敲除小鼠和野生型(wild type，WT)小鼠分别使用激素进行免疫抑制，在肺孢子虫感染的中后期出现了显著的差异，基因敲除小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和γ-干扰素(IFN-γ)明显高于对照组，WT小鼠无此表现。在重度感染组巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)明显升高，并与感染程度呈正相关；在感染中期，基因敲除小鼠的中性粒细胞明显高于WT组，由此说明，SP-A在肺孢子虫感染中起到保护作用，其作用程度与机体感染程度呈正相关。此外，利用SP-D基因敲除小鼠研究发现：SP-D也有抵抗肺孢子虫的作用，它可以增强机体清除力、促进一氧化氮(NO)的新陈代谢[7]。Atochina等[8]对C.B-17 scid/scid小鼠（重度复合性免疫缺陷病小鼠，无需激素诱导）进行了研究，在肺孢子虫感染4周后取BALF进行分离，分为沉淀物、大聚合物、小聚合物肺泡SP。与正常组相比，感染组小鼠SP表达有很大变化，其中小聚合物和磷脂含量明显升高，分别为(240±18)%和(172±16)%(P均<0.001)；而大聚合物肺泡SP磷脂含量明显降低，为(53±5)%(P<0.001)。蛋白质免疫印迹法(Western blot)实验亦证明，肺泡SP-A、SP-D蛋白升高，分别为(720±115)%和(454±135)%(P<0.05)。因此推测，肺孢子虫通过升高SP-A和SP-D蛋白水平来诱导肺泡胶原凝集素上调。
4 分子生物学检查
病原学检查对诊断PCP有价值，通过收集PCP患者痰液或支气管分泌物，涂片镜检可以观察到病原体，但阳性率很低；应用支气管冲洗术可提高检出率。另外，影像学检查如胸部X线、CT检查及氟脱氧葡萄糖-正电子发射计算机断层显像(FDG-PET)[9]，可以支持PCP诊断。半乳糖甘露聚糖、β-葡聚糖亦有助于诊断PCP，并与其预后呈负相关[10]，但是此方法只能判断有真菌感染，不能确诊病原体是否为肺孢子虫，不能满足临床需求。
DNA探针、rDNA探针和PCR技术等有较高的敏感性和特异性，已试用于PCP诊断，不仅可以诊断轻度感染，还可检出亚临床型感染和肺外感染。快速实时探针PCR技术诊断PCP的染色方法与传统一致，但时间可以由原来的24 h缩短为2 h。
用PCR方法对肺组织提取出的cDNA进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳或酶联免疫吸附法(ELISA)与Giemsa染色法进行比较，结果发现，PCR-ELISA法对诊断PCP有较高的灵敏度和特异性，是一种安全简便的方法[11]。安亦军等[12]在对六甲基四胺银（GMS）化学染色和PCR两种方法进行对比后发现，GMS染色方法诊断PCP特异性高，但敏感性偏低(阳性率为35%)，其原因是GMS方法只能使包囊着色，而包囊与滋养体的比例为1∶10，故漏诊率较高。PCR方法检测痰标本中肺孢子虫DNA，阳性率为100%，可以检出痰中微量的虫体DNA，敏感性显著高于GMS染色，因此更适于临床筛查和疗效考核。此外，等位基因PCR（AS-PCR）、单链构象多态性PCR（SSCP-PCR）、逆转录-PCR（RT-PCR）等除了用于PC的检测外，主要用于PC 的种型特异性及临床流行病学研究。
5 治疗药物
甲氧卞氨嘧啶-磺胺甲唑（TMP-SMZ）是传统抗PCP的一线药物。现在国外已经研制出一种新的方法[13]，即从血浆中提取出TMP和SMZ，进行毛细管区带电泳，简单而快捷地测定血液中的浓度，以评估口服药的效果。但缺点是磺胺类药物可以引起中毒性表皮融解坏死（TEN），这是一种少见而严重的不良反应；此外，耐药性的产生也使得磺胺类药物失去其原有的疗效。
由于近年来PCP的发病率呈增高趋势，对治疗PCP的新药研究成果也屡见报道：①North Carolina大学、Georgia州立大学、Auburn大学、Duke大学联合报道称DB-289（DB-75的前体药物）可以治疗PCP、结核、锥虫病和疟疾[14]。②近年国内学者用双氢青蒿素进行了大量体外试验，证明对肺孢子虫表膜有损伤作用，可以降低PCP大鼠肺泡巨噬细胞分泌 NO水平，对大鼠PCP有明显的治疗作用[15，16]。青蒿素是从菊科艾属黄花蒿茎叶中提取的一种含过氧基团的倍半萜内酯,双氢青蒿素是用硼氢化钠还原青蒿素而形成的衍生物，普遍应用于疟疾的临床治疗，但尚未见应用于PCP患者的报道。③Disney等[17]研究发现，烟酸己可碱(Hoechst 33258)有对抗PC的作用，这种复合物能绑定真菌核酸，可以治疗PC以及其他真菌，能直接识别正常哺乳动物体内没有的结构，例如自我剪切的内含子。④在大鼠体内已经证实GW471552和GW471558两种新药物治疗PCP的疗效[18]。在Wistar大鼠激素诱导自发PCP模型中，两种药物（1 mg/kg，每日2次，连续10 d）均显著减少肺中包囊数量；在裸鼠接种模型中也显示出明确治疗效果(0.25 mg/kg，每日2次，连续10 d)。但目前这些新药尚处于研发阶段，没有进行大规模的临床试验，其应用于人体的效果如何尚待进一步深入研究。
综上所述，随着AIDS的蔓延和接受器官移植患者使用免疫抑制剂的增多，导致免疫功能低下，自身抵抗力下降，容易遭受多种病原微生物的侵袭，其中不乏机会致病性病原体，常见的有细菌、真菌和病毒等[19]。其中PCP的感染已经引起国内外的广泛关注，但在预防措施、发病机制、治疗方案等方面还有很多问题有待进一步深入研究和探讨，相关的基础研究和动物实验方面需要加强。由于体外实验大多是针对PC进行，与人体致病虫种PJ有所差异，因此围绕其进行的致病机制、药物疗效等研究如何应用于人体并推广到临床尚待进一步商榷。另外，应尽快研究出更快速精准的检测方法，可以预见，在未来的医学领域，分子生物学诊断技术会占据重要位置，充分发挥其优势，早期发现、早期诊断、早期治疗、合理用药，解决患者病痛。
参考文献：
1 Edman J C,Kovacs J A,Masur H,et al.Ribosomal RNA sequence shows Pneumocystis carinii to be a member of the fungi[J].Nature,1988,334:519-522．
2 张瑞娟.人肺孢子虫的新命名——耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jiroveci)[J].国外医学寄生虫病分册，2003,30:71-74．
3 Keely S P,Renauld H,Wakefield A E,et al.Gene arrays at Pneumocystis carinii telomeres[J].Genetics,2005,170:1589-1600.
4 Crothers K,Beard C B,Turner J,et al.Severity and outcome of HIVassociated Pneumocystis pneumonia containing Pneumocystis jirovecii dihydropteroate synthase gene mutations[J].AIDS,2005,19:801-805.
5 Zimmerli W.Pneumonia in patients with HIV infection[J].Ther Umsch,2001,58:620-624.
6 Linke M,Ashbaugh A,Koch J,et al.Surfactant protein A limits Pneumocystis murina infection in immunosuppressed C3H/HeN mice and modulates host response during infection[J].Microbes Infect,2005,7:748-759.
7 Atochina E N,Gow A J,Beck J M,et al.Delayed clearance of Pneumocystis carinii infection,increased inflammation,and altered nitric oxide metabolism in lungs of surfactant protein-D knockout mice[J].J Infect Dis,2004,189:1528-1539.
8 Atochina E N,Beck J M,Scanlon S T,et al.Pneumocystis carinii pneumonia alters expression and distribution of lung collectins SP-A and SP-D[J].J Lab Clin Med,2001,137:429-439．
9 Win Z,Todd J,AlNahhas A.FDG-PET imaging in Pneumocystis carinii pneumonia[J].Clin Nucl Med,2005,30:690-691.
10Shimizu A,Oka H,Matsuda T,et al.(1->3)-beta-D glucan is a diagnostic and negative prognostic marker for Pneumocystis carinii pneumonia in patients with connective tissue disease[J].Clin Exp Rheumatol,2005,23:678-680.
11陈盛霞,姜旭淦,仇锦波，等.PCR-ELISA检测大鼠卡氏肺孢子虫DNA的研究[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2005,23:48-50.
12安亦军,黄敏君,郭增柱，等.PCR及GMS染色法对肺孢子虫肺炎的临床诊断价值[J].中国寄生虫病防治杂志,2005,18:262-264.
13Teshima D,Otsubo K,Makino K,et al.Simultaneous determination of sulfametho xazole and trimethoprim in human plasma by capillary zone electrophoresis[J].Biomed Chromatogr,2004,18:51-54.
14Yeates C.DB-289 immtech international[J].IDrugs,2003,6:1086-1093．
15李文桂,陈雅棠,刘成伟,等.经双氢青蒿素治疗后卡氏肺孢子虫肺炎大鼠的肺部病理学变化[J].中国人兽共患病杂志,2004,20:223-227.16李文桂,陈雅棠,刘成伟.双氢青蒿素对卡氏肺孢子虫肺炎大鼠NO水平的影响[J].中国寄生虫病防治杂志,2003,16:1-3.
17Disney M D,Stephenson R,Wright T W,et al.Activity of Hoechst 33258 against Pneumocystis carinii f.sp.muris,Candida albicans,and Candida dubliniensis[J]. Antimicrob Agents Chemother,2005,49:1326-1330.
18Jimenez E,Martinez A,Aliouat el M,et al.Therapeutic efficacies of GW471552 and GW471558,two new azasordarin derivatives,against pneumocystosis in two immunosuppressedrat models[J].Antimicrob Agents Chemother,2002,46:2648-2650.
19卢大乔,张红金,陈德昌.肾移植术后重症肺部真菌感染的诊治分析[J].中国危重病急救医学,2005,17:377-378.
基金项目：北京市自然科学基金资助项目(7052026)
作者单位：100050 首都医科大学附属北京友谊医院，北京热带医学研究所
通讯作者：阴赤贞宏(Email:modscn@yahoo.com.cn)
作者简介：王婧，女，硕士研究生。 |
