核转录因子κB及其抑制因子mRNA表达对多器官功能障碍综合征预后判断的作用-危重病急救在线-急救快车

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核转录因子κB及其抑制因子mRNA表达对多器官功能障碍综合征预后判断的作用

来源:中国危重病急救医学2007；20（1）;添加日期:2008-1-31-20:17;编辑:电子期刊

高红梅常文秀李娜李燕曹书华

【摘要】目的 观察核转录因子κΒ（NFκΒ）及其抑制因子（IκB）的mRNA表达水平在多器官障碍综合征（MODS）患者预后评估中的作用。方法将43例MODS患者按预后分为存活组(28例)和死亡组(15例)，选择同期10例健康体检者作为对照。于入院当日使用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）测定血中单核/粒细胞NFκΒ mRNA及IκBα mRNA的表达水平，并比较存活组与死亡组各项数值。结果 MODS患者NFκΒ mRNA表达水平明显高于正常对照组（135±053比074±025，P<001），而IκBα mRNA表达水平明显低于正常对照组（124±060比197±071，P<001）。死亡组NFκΒ mRNA表达水平与存活组比较差异无统计学意义（127±037比139±060，P>005），而IκBα mRNA表达水平则明显低于存活组（094±046比140±061，P<005）。相关分析显示，IκBα mRNA表达水平与急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ（APACHEⅡ）评分呈明显负相关（r=0340，P<005）；且当IκBα mRNA表达水平截断点为134时，其约登指数在各截断点中最高，为051，特异度为9072%，敏感度为6075%。结论 IκB mRNA表达水平可用来判断MODS患者的预后。

【关键词】核转录因子κΒ；κB抑制因子；多器官功能障碍综合征；预后判断

Evaluation of nuclear factorκΒ and IκB mRNA expression in determining the prognosis of multiple organ dysfunction syndrome   GAO Hongmei, CHANG Wenxiu, LI Na, LI Yan, CAO Shuhua. Intensive Care Unit of Tianjin First Central Hospital, Tianjin 300192, China
    【Abstract】Objective   To observe the value of nuclear factorκΒ(NFκΒ) and IκB mRNA expression estimation on determining the prognosis of patients with multiple organ dysfunction syndrome (MODS). Methods   Fortythree MODS patients were divided into two groups based on their prognosis: the survivor group (n=28) and the nonsurvivor group (n=15). Another group of 10 healthy persons served as normal control group. The expression of NFκΒ and IκBα mRNA levels in monocytes/neutrophiles of patients and controls were detected by reverse transcriptionpolymerase reaction (RTPCR), and the results were compared among groups. ResultsThe expression of NFκΒ mRNA levels of MODS patients was higher than that of normal control group（135±053 vs 074±025， P<001），and the expression of IκBα mRNA levels were lower than those of the control group （124±060 vs. 197±071，P<001）. There was no significant difference in NFκΒ mRNA levels between the survivor group and the nonsurvivor group （127±037 vs. 139±060， P>005）, but the expression of IκBα mRNA levels in the nonsurvivor group was significantly lower than that of survivors （094±046 vs 140±061， P<005）. The results suggested that there was a negative correlation between the expression of IκBα mRNA level and acute physiology and chronic health evaluationⅡ（APACHEⅡ） (r=0340, P<005). Moreover, when the cutoff value of the expression of IκBα mRNA level was 134, the Youden index was 051, and it was the highest in all the cutoff values, and the specificity was 9072%，the sensitivity was 6075%. Conclusion The expression of IκBα mRNA level can be a useful guide for determining the prognosis of patients with MODS.
     【Key words】nuclear factorκΒ;IκB;multiple organ dysfunction syndrome;prognosis estimation

     核转录因子κB（NFκΒ）是调节炎症介质基因表达的关键转录因子之一。有研究发现，术后发生多器官功能障碍综合征(MODS)患者的中性粒细胞中NFκΒ活性明显高于未发生MODS者，脓毒症患者单核/粒细胞的NFκΒ活性与其病死率有相关性，提示NFκΒ有可能作为MODS的预警指标〔12〕。NFκΒ的活性主要由NFκΒ mRNA及其抑制因子（IκB）mRNA表达水平决定。本研究中主要观察MODS患者外周血单核/粒细胞NFκΒ及IκB的mRNA表达水平对MODS预后评估的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料：选择2004年1月—2006年12月本院重症加强治疗病房(ICU)收治的43例MODS患者(MODS组)，其中男33例，女10例；年龄24~80岁，平均(5755±2035)岁。MODS的诊断按照1995年Marshall提出的标准〔3〕；疾病严重程度评价按照患者入ICU 24 h内的急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ（APACHEⅡ）评分为标准。器官衰竭情况：2个器官者9例，3个器官者12例，4个器官者10例，5个器官者5例，6个器官者4例，7个器官者3例，平均(381±150)个；发生衰竭的器官和系统：肺脏28例，代谢系统28例，肾脏26例，脑22例，胃肠17例，心脏14例，肝脏10例，循环系统9例，凝血系统8例。在28 d观察期内共存活28例，死亡15例。同期另选10例健康查体者为正常对照组，其中男7例，女3例；年龄30~59岁，平均(5123±1329)岁。各组年龄、性别等一般情况经统计学处理差异无统计学意义(Ｐ>００５)，有可比性(表1，表2)。
1.2 临床处理及指标检测：患者入ICU后均接受抗炎、器官功能支持及营养支持等综合治疗。记录患者入ICU后1、3和5 d各项生理指标的最差值；进行APACHEⅡ评分，评价其病情严重程度。在患者入ICU当日晨8时取肘静脉血8 ml，保存待测。
1.2.1 外周血单核/粒细胞收集：取血后用肝素抗凝，生理盐水1∶1稀释；取尖型离心管；按1∶1～1∶2的体积比加入淋巴细胞分离液(Ficoll液），2 000×g离心20 min，收集白膜层次离心10 min，弃上清液，加入生理盐水1 ml，用枪头反复吹打数次以充分混匀，然后转移入小离心管(EP管)中离心10 min，弃上清液，收集细胞沉淀，70 ℃冻存。
1.2.2 RNA提取：将冻存的外周血单核/粒细胞取出解冻，加入05 ml TRIzol溶液混匀，15～30 ℃静置匀浆液5 min使其充分裂解，加入氯仿01 ml振荡混匀后静置2～3 min。2～8 ℃下12 000×g离心15 min，取出无色水层，加入异丙醇025 ml混匀后静置10 min，离心10 min，在离心管底部与侧面形成的白色小团沉淀即为RNA；弃上清液，加入体积分数为75％的乙醇05 ml冲洗，7 500×g离心5 min，弃上清液；干燥RNA沉淀5～10 min，用焦碳酸二乙酯（DEPC）水10～20 μl溶解。
1.2.3 RNA逆转录(RT)检测：RNA样品置于80 ℃下暂时存放，配制RT反应体系，充分混合，65 ℃加热5 min，冰上孵育3 min，加入200 U/μl的鼠源逆转录酶1 μl混匀，置于37 ℃水浴中孵育1 h，然后72 ℃加热10 min，将RNA逆转录成为互补DNA，20 ℃冻存。
1.2.4 聚合酶链反应(PCR)检测mRNA：β肌动蛋白(βactin)作为内参照，人类βactin、NFκB、IκBα上下游引物均由上海英俊生物技术有限公司合成，βactin引物设计参照文献〔4〕方法，NFκB引物设计参照文献〔5〕方法，IκBα引物设计参照文献〔6〕方法，引物序列见表3。PCR扩增仪条件设定为：94 ℃预变性5 min，然后进行32个循环，包括94 ℃热变性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，最后72 ℃终延伸5 min。βactin、NFκB和IκBα的cDNA经PCR扩增后的产物长度分别为290、406和95 bp。各取βactin、NFκB、IκBα扩增后的产物10 μl，置于新的PCR管中充分混匀，在质量分数为3％的琼脂糖凝胶上电泳（75 V，30 min），溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果并拍照，用凝胶成像分析仪进行半定量分析，用NFκB/βactin与IκBα/βactin
1.3 统计学处理：使用SPSS 100软件,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，行单因素方差分析和q检验；计数资料采用χ2检验；相关性分析采用Logistic分析；Ｐ<００５为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RTPCR检测NFκB mRNA和IκBα mRNA表达见图1～３。
2.1.1 正常对照组与MODS组NFκB mRNA和IκBα mRNA表达水平的比较(表4)：MODS组NFκB mRNA表达水平明显高于正常对照组，而IκBα mRNA表达水平则明显低于正常对照组，两组比较差异均有统计学意义（Ｐ均<001）。
2.1.2 存活组与死亡组NFκB mRNA和IκBα mRNA表达水平的比较(表4)：与正常对照组比较，存活组与死亡组NFκB mRNA表达水平均明显升高（Ｐ均<001），但两组间比较差异无统计学意义（Ｐ>005）。存活组IκBα mRNA表达水平略低于正常对照组，差异无统计学意义（Ｐ>005）；而死亡组IκBα mRNA表达水平明显低于正常对照组，差异有统计学意义（Ｐ<001）；死亡组IκBα mRNA表达水平亦明显低于存活组，差异有统计学意义（Ｐ<005）。
2.2 MODS患者NFκB mRNA、IκBα mRNA表达水平与APACHEⅡ评分的相关性分析：IκBα mRNA表达水平与APACHEⅡ评分呈明显负相关(r=0340，Ｐ<005），NFκB mRNA表达水平与APACHEⅡ评分无相关性（r=０１８１，Ｐ>005）。
2.3 IκBα mRNA表达水平和APACHEⅡ评分对MODS患者死亡预测的受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析(表5)：IκBα mRNA表达水平以及APACHEⅡ评分对MODS的死亡发生均有一定的预测能力(Ｐ<００５)，曲线下面积(AUC)分别为0７４９和0８７３。
2.4   IκBα mRNA表达水平不同截断点对MODS死亡预测的评价(表6)：按ROC曲线，计算IκBα mRNA表达水平不同截断点对MODS死亡预测的敏感度、特异度及约登(Youden)指数。当IκBα mRNA表达水平截断点为1３４时，其Youden指数在各截断点中最高，为0５１，且特异度也较高，为90７２%，敏感度为60７５%。
3 讨论
      MODS的发病机制非常复杂，炎症介质的大量释放形成逐渐放大的“瀑布样”级联反应是造成器官损伤进而导致MODS发生的主要原因〔7〕。近期研究发现，参与MODS多种炎症介质的基因表达在转录水平受到NFκB调控〔89〕。NFκB是近年来新发现的一种转录因子，哺乳类动物NFκB转录因子家族（又称Rel家族）包括5个成员：Rel（cRel）、RelA（又称为p65）、RelB、p50（由前体p105转变而来，p50和p105均称为NFκB1）、p52（由前体p100转变而来，p52和p100均称为NFκB2）〔10〕，具有功能活性的NFκB是由上述成员聚合而成的同或异二聚体。大多数NFκB蛋白N末端都有一个高度保守、由300个氨基酸组成的Rel同源性结构域，负责NFκB与DNA结合、二聚体化及与IκB家族成员相互作用。在体内大多数类型的细胞中，NFκB在细胞浆中与IκB可逆性结合而处于失活状态〔11〕。当肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素、脂多糖(LPS)、病毒感染、炎症细胞因子、氧自由基等刺激后IKK激活，使IκB分子N末端丝氨酸残基区域磷酸化，IκB被泛素化而从NFκB上脱落，NFκB便被活化，活化后的NFκB进入细胞核，与DNA上多种基因增强子区域的特异性序列结合，从而调节多种基因的转录。因此，NFκB的活化受到IκB家族成员的调控。IκB的主要作用为：①阻止NFκB核移位：IκB与NFκB形成复合体掩盖核定位位点，使NFκB不能向核内转移。②阻止NFκB与DNA结合：IκB与NFκB作用，影响NFκB与特定基因序列结合。③促进NFκB与DNA解离：IκB使NFκB从DNA的κB序列解离，并向胞浆转移，抑制相关基因转录。
        在临床试验中发现，NFκB活化后所致的多种炎症介质释放在MODS中起着非常重要的作用，因此有学者提出，NFκB活性的高低可以反映MODS患者病情的危重程度，对MODS的预后具有一定的预警价值〔2〕。在本研究中，存活组患者血单核/粒细胞IκBα mRNA表达水平略低于正常对照组，死亡组表达水平明显低于正常对照组和存活组，IκBα mRNA表达水平与APACHEⅡ评分呈负相关。分析其原因，考虑IκBα mRNA表达升高时，IκBα蛋白相应升高，与p50/p65结合的IκBα较多，从而抑制NFκB活性，NFκB活性下降；IκBα mRNA表达较低时，IκBα蛋白相应降低，与p50/p65结合的IκBα较少，对NFκB的抑制减弱，NFκB活性升高。说明IκBα mRNA间接反映NFκB的活性，与MODS患者预后呈负相关。当IκBα mRNA表达水平截断点定为134时，其敏感度为6075%，特异度为9072%，Youden指数为051。由于对死亡预测要求较高的准确程度，当分界值定为134时，其预测能力分析联合指标即Youden指数在各分界值中最高，且其特异度也较高，故可将134定为判断MODS患者预后为死亡的截断点。

参考文献
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基金项目：天津市医药卫生科技基金资助项目（03KY02）

作者单位：300192 天津市第一中心医院急救医学研究所

作者简介：高红梅，女，硕士生导师，主任医师，现在英国伦敦帝国大学皇家医院做访问学者

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