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多器官功能障碍综合征患者外周血单个核细胞SOCS1/3表达及与预后的关系研究

来源:中国危重病急救医学2007；20（1）;添加日期:2008-1-31-20:15;编辑:电子期刊

陈志斌梁艳冰唐皓林贤寿何东华马中富

【摘要】目的 了解外周血单个核细胞(PBMCs)中细胞因子信号转导抑制因子1/3(SOCS1/3)表达与多器官功能障碍综合征(MODS)预后的关系。方法选择32例MODS患者和24例健康志愿者。采用淋巴细胞分离密度梯度离心法分离PBMCs，分别以逆转录聚合酶链反应及蛋白质免疫印迹法检测PBMCs中SOCS1/3的mRNA及蛋白表达，分析其与预后及MODS评分的关系。结果 MODS组SOCS1 mRNA表达与正常组比较差异无统计学意义（0526±0044比0466±0047，Ｐ>００５），而SOCS1蛋白表达显著高于与正常组（0814±0045比0479±0021，Ｐ<005）；MODS组中死亡者SOCS1 mRNA表达显著低于存活者（0487±0032比0532±0028，Ｐ<005），蛋白表达显著低于存活者（0787±0029比0838±0040，Ｐ<005）；MODS患者SOCS1的mRNA及蛋白表达与MODS评分均呈显著负相关（r１＝0731，r２=0526，Ｐ均<001）。MODS组SOCS3 mRNA表达显著高于正常组（0993±0415比0461±0046，Ｐ<005），SOCS3蛋白表达显著高于正常组(0４58±００３３比０４０3±００２4，Ｐ<００５)；MODS组中死亡者SOCS3 mRNA表达显著高于存活者（1245±0408比0805±0326，Ｐ<005），蛋白表达显著高于存活者（0486±0021比0425±0016，Ｐ<005）；MODS患者SOCS3 mRNA表达与MODS评分呈正相关，但不显著（r＝0468，P＞005），SOCS3蛋白表达与MODS评分呈显著正相关（r=0783，Ｐ<001）。结论 MODS中SOCS1表达可能起到保护组织避免损伤的作用，其表达减少可能提示患者预后不良；SOCS3的表达可能起损伤作用或增加组织对损伤的易感性，其表达增加可能提示病情严重及预后不良。
【关键词】多器官功能障碍综合征；细胞因子；信号转录抑制因子；外周血单个核细胞；预后

Study on the relationship between the expression of SOCS1/3 in the peripheral blood mononuclear cells in patients with multiple organ dysfunction syndrome and their prognosis CHEN Zhibin, LIANG Yanbing, TANG Hao, LIN Xianshou, HE Donghua, MA Zhongfu.Department of General Internal Medicine, The First Affiliated Hospital of SUN Yetsen University, Guangzhou 510080, Guangdong, China Corresponding author: MA Zhongfu
【Abstract】Objective To observe the mRNA and protein expression of suppressor of cytokines signaling protein 1/3 (SOCS1/3) in the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in patients with multiple organ dysfunction syndrome (MODS), and to explore the relationship between the SOCS expression and the patients′ prognosis. Methods Peripheral blood specimens of 32 patients with MODS and 24 healthy volunteers (controls) were collected and the PBMCs were isolated by centrifugation and FicollHypaque sedimentation. The mRNA of SOCS1/3 was determined by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR). And the protein content of SOCS1/3 was determined by Western blotting. The relationship between the SOCS expression and the patients′ prognosis was analyzed. Results There was no significant difference in the SOCS1 mRNA expression between control group and MODS group (0526±0044 vs. 0466±0047, P>005). The SOCS1 expression of MODS group was significantly higher than that of control group (0814±0045 vs. 0479±0021, P<005). In the MODS group, the SOCS1 mRNA expression and protein content of dead patients were significantly lower than those of survived patients (mRNA 0487±0032 vs. 0532±0028, protein 0787±0029 vs. 0838±0040, both P<005). There was significant negative correlation between the SOCS1 mRNA expression and the MODS score (r1=0731， P<001). There was also significant negative correlation between the SOCS1 content and the MODS score (r2=0526， P<001). The SOCS3 mRNA expression of MODS group was higher than that of control group (0993±0415 vs. 0461±0046, P<0.05). The SOCS3 content in the PBMCs of MODS groups was significant higher than that of control group (0458±0033 vs. 0403±0024, P<0.05). In the MODS group, the SOCS3 mRNA expression and protein content of dead patients were significant higher than those of survived patients (mRNA 1245±0408 vs. 0805±0326, protein 0486±0021 vs. 0425±0016, both P<0.05). There was positive correlation between the SOCS3 mRNA expression and the MODS score but the correlation was not significant (r=0468， P>005). And there was significant positive correlation between the SOCS3 content and the MODS score (r=0783， P<001). Conclusion SOCS1 may protect the tissue from further damage while SOCS3 may cause tissue damage indirectly. The detection of SOCS1/3 may help to predict the prognosis of MODS.
【Key words】multiple organ dysfunction syndrome;cytokine;suppressor of cytokines signaling protein;peripheral blood mononuclear cell;prognosis

     研究表明，外周血单个核细胞（PBMCs）在创伤、感染等致病因素下异常活化表达各种炎症因子，是参与多器官功能障碍综合征（MODS）发生发展过程中的重要细胞〔13〕。近年随着分子生物学的进展，人们发现信号转导与转录活化因子（STATs）及其负反馈抑制因子——细胞因子信号转导抑制因子（SOCSs）在炎症介质激活/释放过程中起重要作用。本研究拟探讨SOCS1/3的基因与蛋白表达及其与临床MODS评分及预后的关系，报告如下。
1    资料与方法
1.1   研究对象：选择2007年1—6月在中山大学附属第一医院普内科、急诊科住院，符合2001年美国胸科医师协会/危重病医学会(ACCP/SCCM)提出的MODS诊断标准〔4〕的患者32例，其中男16例，女16例；年龄20~90岁，平均(5953±2211)岁；慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)6例，重症肺炎8例，脓毒症2例，腹膜炎4例，急性呼吸窘迫综合征（ARDS）3例，感染性心内膜炎1例，消化道出血4例，手术创伤后3例，急性肾功能不全1例。正常组为与患者年龄、性别相匹配的健康志愿者24例，其中男12例，女12例；年龄23~85岁，平均(5371±2070)岁。所有患者没有接受抗肿瘤药物、放射治疗和免疫抑制剂治疗，均为非移植、人类免疫缺陷病毒感染（艾滋病）、粒细胞缺乏及长期透析患者。MODS组与正常组一般情况比较见表1。MODS组血白细胞计数及淋巴细胞计数显著高于正常组，提示存在明显的炎症反应过程。
1.2   研究方法
1.2.1 MODS评分：采集健康志愿者晨起空腹、MODS患者确诊48 h内的静脉血，每次6 ml，肝素抗凝。MODS患者采血后按1995年全国危重病急救医学学术会议制定的MODS病情分期诊断标准及严重程度评分标准进行MODS评分〔5〕。
1.2.2 PBMCs中总RNA与蛋白质的提取：采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法〔６〕分离PBMCs。按文献〔４〕介绍的方法和步骤提取PBMCs中总RNA与蛋白质。
1.2.3 SOCS1/3的mRNA表达检测：采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)〔7〕。人类SOCS1/3和内参照βactin引物序列参照文献〔811〕方法以及GeneBank中查出的相应序列，根据引物设计原则用Primer Express 20设计软件设计，由广州达安临床检测中心合成。引物序列如下：SOCS1引物序列SOCS1txt.txt952F、SOCS1 txt.txt1136R，上游序列：5′ACC CCT TCT CAC CTC TTG A3′，下游序列：5′ATA AAG CCA GAG ACC CTC C3′，扩增片断长度为184 bp；SOCS3引物序列SOCS3 txt.txt1466F、SOCS3 txt.txt1587R，上游序列：5′CGG AAC TTG TTT GCT CTT TG3′，下游序列：5′GTG TGA CCA TTT CCT TCG C3′，扩增片断长度为121 bp；βactin引物序列Homo sapiens actin〔gi:5016088〕，上游序列：5′GTG GAC ATC CGC AAA GAC3′，下游序列：5′AGT TGC GTT ACA CCC TTT C3′，扩增片断长度为320 bp。
采用凝胶扫描系统测定PCR扩增产物电泳条带的吸光度(Ａ)值，以β肌动蛋白(βactin)为内参照，计算SOCS1/3条带Ａ值与βactin条带Ａ值的比值，即为扩增产物定量的相对值。
1.2.4 SOCS1/3的蛋白表达检测：采用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)〔12〕检测SOCS1/3蛋白含量，经过上样、电泳与凝胶处理、转膜、染色、压片曝光等步骤，最后将胶片扫描入电脑并以BandScan进行条带灰度分析，以βactin为内参照计算进行半定量分析。
1.3 统计学分析：所有资料使用SPSS 130统计软件进行分析，数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较用方差分析（ANOVA），相关分析用简单相关分析法，用散点图进行标示，同时进行曲线拟合，Ｐ<005为差异有统计学意义。
2   结果
2.1 MODS患者PBMCs中SOCS1/3的mRNA和蛋白表达(表2，图1~4)：MODS组与正常组SOCS1 mRNA表达比较差异无统计学意义（P＞005）；MODS组SOCS1蛋白及SOCS3 mRNA和蛋白表达均显著高于正常组（Ｐ均<005）。
2.2 死亡与存活患者PBMCs中SOCS1/3的mRNA和蛋白表达(表3)：MODS组中存活患者PBMCs中SOCS1的mRNA及蛋白表达均显著高于死亡患者（Ｐ均<005）；而SOCS3的mRNA和蛋白表达均显著低于死亡患者（Ｐ均<005)。
2.3 MODS患者PBMCs中SOCS1/3的mRNA和蛋白表达水平与MODS评分的相关性：SOCS1 mRNA表达与MODS评分呈显著负相关（r=0731，Ｐ<001），SOCS1蛋白表达与MODS评分呈显著负相关（r=0526，Ｐ<001）；SOCS3 mRNA表达与MODS评分呈正相关（r=0468，P＞005），SOCS3蛋白表达与MODS评分呈显著正相关（r=0783，Ｐ<001)。
2.4 死亡与存活患者的年龄与MODS评分比较(表4)：MODS存活患者平均年龄大于死亡患者，但差异无统计学意义；存活患者MODS评分显著低于死亡患者（Ｐ<005）。
3 讨论
    MODS的发病机制涉及到神经、体液、免疫、内分泌、凝血与微循环、代谢、微生态等多个环节，目前尚未完全清楚，其中研究最多的是炎症介质。在动物实验中给予炎症介质可以复制出类似MODS的病理生理状态，相应的炎症介质拮抗剂往往能够起到缓解作用；然而多项通过抗炎介质治疗MODS的临床试验结果并不理想。学者们提出，在MODS发生发展过程中涉及到大量的炎症介质，它们之间构成了一个复杂的网络关系，单纯针对某一种或几种炎症介质可能会破坏这一网络，导致无法预料的“骨牌效应”。近年来发现了JAK/STAT通路的内源性抑制因子SOCS，通过对JAK/STAT通路的抑制可能在机体的免疫自稳中发挥重要作用。多项研究指出，SOCS参与了炎症性疾病的发生发展过程。目前国内外对MODS的SOCS作用临床研究报道不多。SOCS1与γ干扰素(IFNγ)信号转导抑制以及T淋巴细胞活化有重要作用，组织SOCS1表达可以减低组织对炎症反应的易感性〔1315〕，抑制STAT1诱导前调亡信号的表达，从而起到保护组织的作用〔16〕。本研究中，MODS组SOCS1 mRNA表达较正常组稍高；MODS组中死亡患者SOCS1的mRNA及蛋白表达均明显低于存活患者，SOCS1的mRNA及蛋白表达均与MODS评分呈显著负相关，提示在MODS中SOCS1被诱导表达，可能起着保护作用，与预后有关。病情严重者SOCS1表达更低，提示这些患者STAT1活化较少受到SOCS1抑制，组织对炎症反应的易感性增加，进一步导致组织损害甚至脏器功能损害。因此SOCS1 mRNA表达可以作为一个判断预后的指标，诱导危重患者的SOCS1表达，或者抑制STAT1活性，对于MODS的干预治疗可能有帮助。SOCS3可以被多种炎症介质或抗炎介质所诱导，包括白细胞介素6(IL6)、IL12、IFNγ、IL10等，SOCS3被诱导产生后可以对上述介质的作用以及相应STAT3活性产生负反馈调节。目前较多学者认为STAT3在急性炎症过程中主要扮演着保护组织避免损伤的角色，SOCS3表达对STAT3的抑制可能导致炎症过程不受控制〔12，1720〕。本研究中，MODS组PBMCs中SOCS3 mRNA表达明显高于正常组，MODS组中死亡患者SOCS3的mRNA及蛋白表达显著高于存活患者，且SOCS3的mRNA及蛋白表达与MODS评分呈正相关，提示SOCS3在MODS发病过程中被诱导表达后起着促进炎症损伤的作用，同样也与预后有一定关系；SOCS3表达较高者其病情也较重，预后较差，提示这些患者体内STAT3可能受到过度抑制而无法发挥保护作用。SOCS3表达与MODS评分相关性不显著，主要是在部分患者的SOCS3表达较高而MODS评分较低，这部分患者病情与指标不平衡，需要对其病情以及MODS评分进行进一步动态观察，或者增加样本例数，才能进一步明确SOCS3表达与病情是否存在关系。综上所述，在SIRS/MODS的发生发展过程中，SOCS1的表达可能起到保护组织免受损伤的作用，其表达减少可能提示预后不良；SOCS3表达可能起着损伤组织或增加组织对损伤易感性的作用，其表达增加可能提示病情严重及预后不良。

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基金项目：广东省科技计划项目(2004B30601002)；广东省广州市科委重点攻关课题（2001Z13002）
作者单位：510080 广州，中山大学附属第一医院普内科(陈志斌，梁艳冰，唐皓，林贤寿，马中富)；中山大学达安基因公司（何东华）

通讯作者：马中富，教授，博士生导师

作者简介：陈志斌，男，医学硕士，医师

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