王娟 刘志锋 徐佳 杨莉 李志杰 邓鹏 姜勇
【摘要】 目的 建立研究DNA蛋白质相互作用的新方法。方法 选择6只SPF级BALB/c小鼠，模型组经尾静脉注射脂多糖(LPS)25 mg/kg，使平均动脉压(MAP)降至40 mm Hg(1 mm Hg=0133 kPa)造成内毒素休克，然后迅速处死，正常对照组同期处死，取肝脏组织。利用生物素链亲和素系统结合磁珠分离技术筛选内毒素诱导基因（LIG）启动子的结合蛋白。用聚合酶链反应(PCR)扩增末端带生物素标记的LIG启动子探针，提取动物肝脏组织胞核蛋白，与制备的LIG启动子探针进行孵育，再以标记有链亲和素的磁珠分离LIG启动子蛋白反应复合物，使用不同浓度NaCl洗脱结合的蛋白，使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分离样品蛋白，并对凝胶进行银染显色，比较模型组与正常对照组的差异条带。结果 两组胞核蛋白中共观察到15条差异条带。分析差异条带显示，与正常对照组比较，在低亲和力作用水平，LPS作用后有4个蛋白开始与LIG启动子作用力增强，而有1个蛋白则同启动子的相互作用减弱；在DNA蛋白质高亲和力作用水平，则有9个蛋白因LPS刺激而同DNA的结合力增强，有1个蛋白同启动子的相互作用消失。结论 成功建立了生物素链亲和素结合磁珠分离技术的新方法，为研究DNA蛋白质相互作用开拓了新思路，并从“转录调控组学”角度深入理解基因表达调控机制奠定了基础。
【关键词】DNA蛋白质相互作用；启动子；生物素链亲和素；基因表达调控
A new method for screening binding proteins that interact with the promoter of lipopolysaccharide inducible genes and its application WANG Juan, LIU Zhifeng, XU Jia, YANG Li, LI Zhijie, DENG Peng, JIANG Yong. Department of Pathophysiology and Key Laboratory of Functional Proteomics of Guangdong, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong, China
Corresponding author: JIANG Yong
【Abstract】 Objective To establish a new method for the study of DNAprotein interaction. Methods Six SPF BALB/c mice were divided into two groups, the lipopolysaccharide (LPS)treated group (n=3) and the normal control group (n=3). The LPStreated mice were subjected to tail veininjection of LPS (25 mg/kg) to reproduce an endotoxic shock model. The biotinlabeled DNA probe for the LPS inducible gene (LIG) promoter was amplified by polymerase chain reaction (PCR). The cell nuclear extracts from liver of mice were prepared and mixed together. DNA pulldown assays were performed by using magnetic beads conjugated with streptavidin. Proteins binding on the beads were eluted by salts with different concentrations. The samples were resolved by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE) and displayed by silverstain to compare differential bands between two groups. Results Fifteen proteins in the nuclear extracts were found to be different between the mice of two groups. Analysis of the differential bands of SDSPAGE displayed that, compared with normal control group, there were four proteins increased and one protein declined in the mice treated with LPS when eluted with low salt. While under the condition of high affinity elution, there were nine proteins increased and one disappeared after LPS treatment. Conclusion In this study, a novel method was set up by combining the biotinstreptavidin system and magnetic beads isolation technique, providing a new way to study DNAprotein interaction. This strategy is helpful for further understanding the regulation of gene expression with a view of "omics".
【Key words】DNAprotein interaction；promoter；biotinstreptavidin；gene expression regulation
随着人类基因组测序工作的基本完成，功能基因组学研究更显重要，而基因表达调控是功能基因组学的一个重要研究领域〔1〕。事实上，基因表达调控是细胞对外部或内部刺激发生应答的方式，涉及基因组DNA和一系列结合蛋白的相互作用。不同生理条件下特异性的基因转录调控依赖于不同的反式作用因子与顺式作用原件的特异性结合。因此，深入研究基因表达调控的分子机制，必须要研究DNA蛋白质的相互作用，即需要明确哪些转录因子与哪些基因的转录调控区域发生了特异性结合〔23〕，建立有效的研究方法可以大大促进该领域的研究。本研究建立了生物素链亲和素系统结合生物质谱技术，进行启动子结合蛋白的筛选鉴定，取得了满意的效果。本研究拟以内毒素诱导基因（LIG）启动子结合蛋白的研究来阐明此方法，并对其优势进行分析。
1 材料与方法
1.1 实验材料:含有LIG启动子序列的质粒由本实验室保存；SPF级BALB/c小鼠购自南方医科大学实验动物中心；Blend Taq DNA多聚酶购自日本TOYOBO公司；鲑鱼精DNA和琼脂糖均购自美国Sigma公司；引物由日本TaKaRa公司合成；质粒DNA提取纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自安徽Ugene公司；考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒购自德国Merck公司；Dynabeads Kilobase Bindertm试剂盒购自挪威Dynal公司。
1.2 内毒素休克模型的制备:用乌拉坦（6 ml/kg）腹腔注射麻醉6只小鼠后，固定并分离右侧颈总动脉。经右侧颈总动脉插入直径60 mm的PE50聚乙烯管，并与压力传感器和4道生理记录仪连接，稳定30 min后记录小鼠正常平均动脉压（MAP），并经尾静脉注射脂多糖(LPS)25 mg/kg，监测血压降至约40 mm Hg(1 mm Hg=0１３３ kPa)时迅速处死大鼠；正常对照组小鼠尾静脉注射等量磷酸盐缓冲液(PBS)，与模型组同时间点放血处死。处死后迅速取出肝脏组织，用冰PBS漂洗，置液氮中保存备用。
1.3 肝组织胞核蛋白提取及蛋白定量：将组织块称重后置液氮中研磨、匀浆、离心，取上清液即为胞浆蛋白；将胞核沉淀用匀浆缓冲液洗涤、离心，收集沉淀。将沉淀用核提取缓冲液涡旋振荡重悬沉淀，冰上摇动，离心取上清液即为核提取物。再用PBS透析过夜，4 ℃高速离心，80 ℃保存备用。取上清液用考马斯亮蓝法定量蛋白浓度。分别取蛋白标准品（2 g/L）200、150、100、50和25 μl，依次用200、250、300、350和375 μl的1×PBS稀释至终体积400 μl。各取10 μl加到96孔板的标准品中，取10 μl 1×PBS作为空白对照，加200 μl考马斯亮蓝蛋白定量试剂，混匀后室温放置5 min。用HTSE7000多孔阅读器测定595 nm波长下的吸光度（Ａ)值。每组设2个复孔，最后取平均值，各值减去空白对照值后制作标准曲线，同时给出直线线性回归方程式，按标准曲线公式计算出样品中的蛋白浓度。
1.4 末端带生物素标记LIG启动子探针的扩增及制备：分别设计LIG启动子上下游引物，并在其5′末端标记生物素。聚合酶链反应(PCR)反应条件为：94 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃、2 min，35个循环。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，按UGene凝胶回收试剂盒操作要求回收目的条带，用DNA定量仪对产物进行定量，20 ℃保存备用。每组取20 μl Dynal磁珠置于50 μl结合缓冲液中（按试剂盒说明书操作）洗涤2次后，重悬于50 μl结合缓冲液，加10 pmol带生物素的LIG启动子片段，室温下轻柔摇动3 h，用50 μl洗涤缓冲液洗磁珠2次，重悬于PBS中备用。用10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA，pH 82）及体积分数为95％的甲酰胺，在90 ℃条件下孵育2 min，洗脱磁珠上结合的探针，用质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测磁珠结合的探针量。
1.5 DNA下拉分析(DNA pulldown)实验：取每组鼠透析后的胞核蛋白提取物05 mg，分别加入5 μl鲑鱼精DNA（10 g/L），室温下轻摇15 min，在转子中加入上述磁珠探针混合物，置于室温转动30 min，去上清液；用50 μl 1×PBS洗磁珠2次，再分别用20 μl 025 mol/L NaCl和1 mol/L NaCl洗脱磁珠上结合的蛋白，洗脱液用质量分数12%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)。
1.6 SDSPAGE的银染：将凝胶按EMBL标准方法进行银染，用Na2S２O3溶液致敏,ddH２Ｏ洗涤，AgNO３溶液室温孵育，再用ddH２O洗涤，加甲醛、Na2CO3溶液显色，乙酸溶液终止反应并保存凝胶。观察正常对照组与模型组间的差异条带。
2 结果
2.1 肝组织的核质分离(图1)：提取模型小鼠和正常对照小鼠肝脏组织胞质和胞核提取物，经1×PBS透析浓缩后行SDSPAGE，可见胞质与胞核的带型明显不同。
2.2 蛋白定量(图2)：用蛋白标准品按考马斯亮蓝法制备蛋白定量标准曲线，得方程Y=0321 2X＋0075。定量各组蛋白浓度约为30 g/L。
2.3 末端带生物素标记LIG启动子探针的扩增(图3)：1%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，可见一约2 000 bp大小的特异性条带，与预期大小一致。
2.4 DNA pulldown结果
2.4.1 磁珠结合探针量的琼脂糖凝胶电泳检测(图4)：在磁珠洗脱液中2 000 bp左右处可见一明亮条带，并且根据结合前后反应液中的探针量发现，磁珠结合的探针量已达到饱和，而95%甲酰胺溶液可将结合在磁珠上的探针几乎完全洗脱。
2.4.2 胞核蛋白和LIG启动子结合蛋白的SDSPAGE分析(图5)：分析差异条带结果可见，低浓度NaCl洗脱时，可洗脱出同DNA亲和力弱的蛋白，在模型组和正常对照组共可见5条差异条带；高浓度NaCl洗脱高亲和力蛋白时可见10条差异条带。与正常对照组比较，在低亲和力作用水平，LPS作用后有4个蛋白开始与LIG启动子作用力增强，而有1个蛋白则同启动力的相互作用减弱；在DNA蛋白高亲和力作用水平，则有9个蛋白因LPS刺激而同DNA的结合力增强，有1个蛋白同启动子的相互作用减弱。
3 讨论
目前对启动子DNA结合蛋白的研究方法可分为两大类。第一类是细胞内方法，以已知的启动子DNA序列筛选与其相结合的蛋白编码基因，通过生物信息学分析来确定该蛋白质的名称。由于是细胞内筛选，因此这类方法更符合生理状态，且操作简便，适合高通量筛选用于寻找未知基因及蛋白质。但此类方法也存在两种缺陷：一是只能筛选可与启动子DNA 特异性结合的蛋白，但不能检查出精确的蛋白质结合位点；二是特异性需要进一步验证。这类方法包括酵母单杂交技术、噬菌体表面展示技术等。第二类是细胞外法，即在体外用重组的已知蛋白质与启动子DNA结合。该法特异性好，并且能够在启动子DNA序列上找到精确的蛋白质结合位点。这类方法包括凝胶阻滞实验、DNase足迹试验等〔45〕。但这种方法效率低、操作复杂，一般不用于寻找未知基因及蛋白质。我们在现有方法的基础上，将两种方法结合应用，以期达到既能找到未知调控蛋白、又能够找到该蛋白精确结合位点，以及证实二者结合特异性的目的。为此我们将生物素链亲和素系统和磁珠分离技术和生物质谱技术引入到启动子结合蛋白的筛选鉴定研究中。
生物素链亲和素系统是近几年来应用广泛的一门生物学技术，二者以超强的非共价键特异性结合，且这种结合高度稳定；二者都可以耦联蛋白质、核酸、糖和酶等生物活性物质，一个蛋白质（或核酸等）分子上可结合多个生物素分子，而一个亲和素又可结合4个生物素，因而两者的结合具有多级放大作用〔6〕。磁珠分离技术具有重复性好、结合效率高、操作方便等优点，这些特性使得这一系统在鉴定DNA蛋白质相互作用方面表现出特有的优势。同时，生物质谱技术的应用及其与生化手段的有效结合，为鉴定参与DNA蛋白质相互作用提供了无可比拟的强大手段〔78〕。 这种策略较传统的研究方法具有很多的优点：①对拟研究的传导对象不作任何假设，可以同时鉴定同一因子引发多种细胞内事件中与基因启动子产生相互作用的蛋白质。因此，这种研究方法不存在偏倚，有利于我们发现可能参与基因转录调控的新蛋白或者新的调控关系。②应用DNA蛋白质相互作用技术缩小了研究范围，锁定被研究组织中与基因启动子结合的蛋白群，再用质谱鉴定，大大提高了研究效率。③实验操作简便，传统方法对上述转录调节分子的鉴定通常需要不同实验室历经十余年的时间方能鉴定出来。目前关于基因表达调控的研究大都是在特定类型的动物细胞或细胞株的水平来开展的，不能准确反映机体各组织器官整体水平的表现，基于上述这些因素，我们结合生物素链亲和素系统和磁珠分离技术，在内毒素休克小鼠的肝组织中，根据DNA蛋白质相互作用的原理，成功筛选到了LIG启动子区的结合蛋白〔９〕。结果显示低浓度NaCl洗脱时可洗脱出同DNA亲和力弱的蛋白，在模型组和正常对照组共可见5条差异条带；高浓度NaCl洗脱时，高亲和力蛋白可见10条差异条带，而且多次重复实验均能得到相同的结果。质谱鉴定出各作用蛋白后，进一步研究鉴定的转录调控蛋白对启动子的调节作用、二者的作用位点及其相关的信号转导通路〔１0〕，形成由下至上的研究模式，为从“转录调控组学”的角度分析基因表达的信号调控过程及其机制奠定了基础〔11〕。
参考文献
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基金项目：国家重点基础研究发展计划(973)基金资助项目(2002CB513005)；国家自然科学基金资助项目(30670828，30572151)；广东省科技计划基金资助项目(A1090202)
作者单位：510515 广州，南方医科大学病理生理学教研室，广东省蛋白质组学重点实验室
通讯作者：姜勇
作者简介：王娟，女，硕士研究生 |
