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Flt3配体对多器官功能障碍综合征小鼠脾脏树突状细胞及细胞免疫功能的修复作用

来源:中国危重病急救医学2007；20（1）;添加日期:2008-1-31-20:1;编辑:电子期刊

田光陆江阳王宏伟刘茜杨毅

【摘要】目的 探讨Flt3配体（FL）对多器官功能障碍综合征(MODS)晚期免疫失衡的修复作用与意义。方法按随机数字表法将90只实验鼠分为正常对照组、MODS组和FL治疗组，每组30只。用流式细胞技术检测各组脾脏树突状细胞（DC）、外周血单个核细胞主要组织相容性复合物Ⅱ类分子(IAb)表达变化及T细胞亚群变化，光、电镜下观察脾脏组织结构和DC变化。结果 MODS组脾脏中未成熟DC明显增加(Ｐ<００５)；外周血单个核细胞IAb表达及CD4/CD8比值明显下降(Ｐ<００１和Ｐ<００５)；脾脏白髓消散，脾小体明显减少，DC多呈凋亡与退变崩解改变，周围淋巴细胞大量凋亡；活杀前动物死亡率为18%。治疗组小鼠脾脏中成熟DC数量明显增加(Ｐ<００５)；外周血单个核细胞IAb表达接近正常水平，CD4/CD8比值较MODS组明显上调；脾脏组织形态与DC的病理改变较MODS组明显减轻；实验鼠死亡率(7%)也明显降低。结论 FL可以通过促进DC增生和活化，有效改善MODS晚期细胞免疫功能，进而缓解MODS的进程。

【关键词】Flt3配体；多器官功能障碍综合征；树突状细胞；耐受性树突状细胞；脾脏

Flt3 ligand in recovering the function of the splenic dendritic cells and the immune system in mice with multiple organ dysfunction syndromeTIAN Guang, LU Jiangyang, WANG Hongwei, LIU Qian, YANG Yi. Department of Pathology, First Affiliated Hosptial of General Hospital of PLA, Beijing 100037, China
Corresponding author: LU Jiangyang (Email: lujy@263. net)
     【Abstract】Objective   To stduy the immunoprotective effect of fmslike tyrosine kinase receptor 3 ligand (FL) in multiple organ dysfunction syndrome(MODS) in mice. Methods Ninety mice were randomized into three groups: normal, MODS and MODS+FL (each n=30). The MODS model of mice was reproduced. Splenic dendritic cell (DC), IAb of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and T cell subpopulation of peripheral blood of mice were analyzed by flow cytometry. The histomorphology of spleen and DC was studied by light microscope and electron microscope. Results In MODS group, the number of splenic immature DC increased （P<005）， the number of CD4＋T lymphocytes reduced, while the number of CD8＋T lymphocytes increased, thus CD4/CD8 ratio was reduced (Ｐ<００５). White pulp of the spleen dispersed, with decrease in splenic bodies. There was apoptosis of DC. The expression of IAb of the mononuclear cells decreased remarkably (Ｐ<００１). The mortality of mice before treatment was 18%. In FL treatment groups, the number of splenic mature DC was markedly increased (P<0.05). The number of CD4＋T lymphocytes and CD4/CD8 ratio was also markedly elevated. The expression of IAb of the mononuclear cells became normal. The pathological changes in spleen were alleviated. The mortality rate was significantly lowered (7%). Conclusion FL can not only stimulate the recovery the DC activity, but also improve the immune function in the late phases of MODS.
     【Key words】fmslike tyrosine kinase receptor 3 ligand;multiple organ dysfunction syndrome;dendritic cell;tolerogenetic dendritic cell;spleen

    在多器官功能障碍综合征（MODS）病程后期，机体出现免疫抑制或免疫麻痹是形成多器官功能衰竭(MOF)进而引起死亡的关键因素，而树突状细胞(DC)的活性变化对免疫功能状态具有重要意义〔17〕。因此，寻找能够有效地改善细胞免疫功能，尤其是修复DC活性的措施，是当前国内外有关MODS防治研究的重要课题。Flt3配体（fmslike tyrosine kinase receptor 3 ligand，FL）是一种可以促进多种干细胞、血细胞及其前体细胞生成和分化的细胞因子。FL在体内可促进DC的增殖和分化，诱导抗肿瘤和抗病毒的免疫应答反应〔89〕。但是对于FL在MODS等严重创伤感染并发症中的免疫修复作用与意义还没有引起重视。本研究拟探讨鼠重组FL对MODS小鼠免疫抑制的防治作用，为MODS免疫功能障碍的防治提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组：雄性C57BL/6小鼠90只，6～8周，体重20～25 g，购自军事医学科学院实验动物中心。按随机数字表法分为正常对照组、MODS组和治疗组，每组30只。
1.2 模型制备与动物处理：参照文献〔1011〕方法制模。酵母多糖粉剂（美国Sigma公司）1 g，医用液体石蜡油40 ml，制成25 g/L的酵母多糖悬浊液，100 ℃水浴中消毒80 min，冷却至室温待用。制模时MODS组与治疗组小鼠均经腹腔注射酵母多糖悬浊液1 mg/g；治疗组从致伤后5 d起腹腔注射鼠重组Flt3L（美国Cytolab公司，5 μg/kg)，连续给药7 d。MODS组小鼠于致伤后10~12 d形成MODS模型后活杀取材；治疗组于致伤后12 d活杀取材；正常对照组于麻醉后处死。
1.3 脾脏CD11c和主要组织相容性复合物Ⅱ类分子(IAb)标记检测：将500 μl胶原酶D（美国Sigma公司）注入各组新鲜脾脏标本中，剪碎组织，37 ℃孵育25 min，加入10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)后孵育5 min；用研磨棒于400 目金属网上研磨，收集细胞悬液，170×g离心10 min；加入2 ml的红细胞裂解液（美国BD公司），样品颠倒4次，避光孵育8 min；170×g离心4 min，弃上清液。将细胞悬浮于2 ml的磷酸盐缓冲液(PBS)中，苔盼蓝染色，血细胞计数板涂片，光镜下观察活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为1×109个/L；加入抗体藻红蛋白(PE)CD11c和异硫氰酸荧光素(FITC)IAb（美国biolegend公司）各05 μl，混匀，4 ℃下放置30 min，01 mol/L PBS漂洗细胞3次，用体积分数为1%的多聚甲醛固定细胞，流式细胞仪检测。
1.4 外周血单个核细胞IAb标记检测：取各组小鼠抗凝血100 μl，置于含1 μl FITCIAb抗体（美国biolegend公司）试管中混匀，室温放置30 min。加入红细胞裂解液2 ml混匀，室温放置15 min，280×g离心4 min，弃上清液。加入PBS，在流式细胞仪上观察IAb标记阳性的单个核细胞的数量及百分比。
1.5 外周血T淋巴细胞表型分析：取各组小鼠抗凝血100 μl，置于含有抗FITCCD4与CD8抗体（美国biolegend公司）各5 μl的试管中，混匀，室温放置30 min；加入红细胞裂解液2 ml，立即混匀，室温放置15 min，280×g离心4 min，弃上清液。加入PBS，在流式细胞仪上测定细胞CD4与CD8的表达。
1.6 光镜下观察:取各组小鼠脾脏组织，用体积分数为10%的中性甲醛固定，常规石蜡制片，苏木素伊红(HE)染色后用光镜(低倍放大)观察。
1.7 透射电镜下观察:切取各组小鼠新鲜脾脏组织，用体积分数为3%的戊二醛固定，常规透射电镜制片，醋酸铀枸橼酸铅双染后用JEM1010透射电镜观察。
1.8 统计学分析:数据处理采用Stata 70版统计分析软件，以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验进行数据统计分析，P＜005为差异有统计学意义。
2   结果
2.1 实验鼠症状与死亡率:MODS组小鼠多表现为嗜睡少动、呼吸急促、精神萎靡、眼目不睁、被毛脏湿、身体抖动和拒绝饮食，活杀前动物死亡率为18%；治疗组小鼠的状态明显好于MODS组，活杀前动物死亡率降至7%(Ｐ<００５)。
2.2 脾脏病理学改变
2.2.1 光镜下观察(彩色插页图1a~c)：MODS组小鼠脾脏白髓明显萎缩，动脉周围淋巴鞘消散，成熟淋巴细胞大量减少；脾小体稀少且滤泡生发中心不明显，白髓与红髓分界不清；红髓内可见中性粒细胞浸润。治疗组脾脏白髓淋巴细胞明显增多；脾小体数目接近正常对照组。
2.2.2 电镜下观察(彩色插页图2a~c)：正常对照组脾脏DC胞体较大，多呈细长形，表面形成数个突起，并向周围淋巴细胞的间隙延伸，胞质电子密度较低，细胞器不发达，DC周围多见一些淋巴细胞围绕。MODS组脾脏DC多呈退变崩解与凋亡改变，周围多见凋亡淋巴细胞围绕。治疗组脾脏DC呈现机能活跃状态改变，表现为DC胞体增大，突起延长，胞质、细胞器也增，周围可见少量凋亡淋巴细胞。
2.3 脾脏DC免疫表型分析(图3)：伤后10～12 d MODS组脾脏DC较正常对照组显著增多（Ｐ<005），增生的DC以未成熟DC（CD11c+/IAb－）为主。治疗组脾脏DC较正常对照组和MODS组均显著增加（Ｐ均<005），其中表达成熟DC(CD11c+/IAb+)的数量增加更加明显，与正常对照组和MODS组比较差异均有统计学意义（Ｐ均<005）；而未成熟DC数量低于MODS组，但仍显著高于正常对照组(Ｐ均<００５)。
2.4 外周血单个核细胞IAb的标记结果(图4)：MODS组外周血单个核细胞IAb表达明显下降，与正常对照组比较差异有统计学意义（Ｐ<001）；治疗组外周血单个核细胞IAb表达增加，接近正常对照组水平，与MODS组比较差异有统计学意义（Ｐ<001），提示抗原呈递细胞与DC的免疫活性恢复，细胞免疫功能得到改善。
2.5 外周血T淋巴细胞表型分析(图5)：MODS组CD4＋T细胞数目减少，CD8+T细胞数目明显增高,CD４＋/CD8+比值下降，与正常对照组比较差异均有统计学意义（Ｐ均<005），提示细胞免疫功能降低。治疗组CD4＋T细胞数目增加恢复至正常对照组水平，CD8+T细胞较MODS组显著下降（P<0.05），致CD4＋/CD8＋比值回升，恢复至正常对照组水平，提示细胞免疫功能得到恢复。
3   讨论
    关于MODS后期增强免疫的防治措施，已经做了大量研究和临床应用，但疗效欠佳。原因是治疗靶点不明确，且特异性和针对性差。我们在前期的研究中发现，MODS后期，DC活性下降及其诱导的淋巴细胞大量凋亡在免疫抑制和MODS形成中具有关键性作用〔37〕。如果能在此期采取有效措施，提高DC活性，可能会缓解免疫失衡和免疫抑制，避免MODS的发生。FL是一种可以促进多种干细胞、血细胞及其前体细胞生成、分化的细胞因子，无论在实验条件下还是在生理条件下都有作用，与多种细胞因子都有协同作用，而且FL对细胞形态和细胞表型都没有影响，是一种良好的扩增剂。体外实验已经证实，FL能促进骨髓、脐血来源的CD34+造血干细胞向DC分化，增强粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导产生的DC扩增，使DC的数量增加1倍以上。体内实验亦发现，应用FL可使小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及肝脏中DC呈时间依赖性增加〔8,9,1217〕。脾脏是最大的外周免疫器官，也是淋巴细胞活化和发挥免疫应答效应的重要场所。以脾脏为代表的外周免疫器官的功能状态在维持机体免疫反应与炎症反应平衡中起到至关重要的作用。CD11c在成熟与未成熟DC中均有表达，是一种较敏感的DC标志物。而IAb是小鼠组织相容抗原Ⅱ类分子，只有在活化的抗原呈递细胞表面才有其受体存在，故IAb的表达情况直接反映了小鼠抗原呈递细胞的功能状态。由于DC是抗原呈递细胞最主要和最有效的成分，所以IAb也可以被视为活性或成熟DC的标志物。本研究采用CD11c与IAb联合双标检测，可以更有效地鉴别成熟与未成熟DC。

本研究结果表明：MODS 晚期小鼠外周血单个核细胞表面IAb表达显著减少，CD4＋/CD8+T细胞比例严重倒置、比值明显下降，提示机体细胞免疫水平严重下降，进入免疫抑制状态。虽然此时脾脏DC仍然增生，但以CD11c+/IAb－的未成熟DC为主；脾脏DC萎缩退变，呈凋亡与崩解改变；脾白髓淋巴细胞消散。经腹腔注射FL治疗的小鼠脾脏DC体积增大、数目增生，且以CD11c+/IAb+的成熟DC为主；外周血单个核细胞IAb表达较MODS组显著增高，白髓淋巴细胞明显增多，外周血中CD4＋T细胞数量也相应增加，CD4＋/CD8＋比值恢复至正常水平，而且实验鼠的死亡率也从MODS组的18%下降到治疗组的7%。表明FL作用后机体的细胞免疫功能得到了修复和改善。在严重创伤感染与MODS的早期，免疫器官与外周血中的DC表现为大量增生与功能活跃，致使机体出现过高免疫反应和炎症反应，从而参与了MODS的启动机制。在经过病程缓解期（5~7 d）以后的MODS期，DC数量仍有明显增生，但其免疫活性明显减低。以往研究认为，MODS时的免疫抑制可能与病程前期DC和淋巴细胞的大量消耗以及退变凋亡有关〔35〕。近年有研究表明，DC是一种双向免疫调节子：既可以诱导机体的免疫应答反应，同时又具有负向免疫调节作用，籍此维持机体的免疫平衡〔1821〕。DC依功能可分为静止DC、活化DC和耐受性DC。DC的负相调节功能主要是通过耐受性DC来实现的，其在生理条件下诱导免疫耐受，而在病理条件下则诱导免疫抑制和免疫麻痹。耐受性DC可通过诱导T细胞失能、免疫反应偏移、调节性T 细胞形成及促使活化的T细胞凋亡等途径来行使其负相调节功能。在MODS缓解期至终末期（12 d）的DC处于失活或耐受状态，变成所谓“耐受性DC”，发挥了负相免疫调节作用，导致T细胞失能或免疫抑制。就是说在MODS后期DC不但功能失活，而且免疫调节方向也发生了变化。可以认为，在MODS缓解期输入的FL可通过扩增DC前体细胞的数量并激活DC活性，逆转“耐受性DC”的作用方向，增强DC刺激T细胞活化的能力，使细胞免疫功能得到恢复和加强。

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基金项目：全军“十一五”医学科研项目基金(06MB307)；首都医学发展科研基金(20033025)作者单位：100037北京，解放军总医院第一附属医院(原解放军三○四医院)病理科

通讯作者：陆江阳，博士生导师，主任医师

作者简介：田光，男，博士研究生，主要从事创伤及危重病的免疫病理学研究(现在军事医学科学院微生物流行病学研究所病理研究室工作)

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