王君 李海红(综述) 付小兵 李存保(审校)
【关键词】 创伤；骨髓细胞；细胞分化
皮肤是人体最大的器官，具有抵御外界微生物入侵、排泄、防止水分蒸发、调节体温等重要作用，同时也是免疫系统的组成部分。目前对烧/创伤皮肤缺损的治疗常采用自体皮肤移植方法，但大面积烧/创伤患者常常存在自体皮肤不足的状况。近十余年，组织工程学的发展为大面积皮肤缺损修复开辟了新的途径，虽然研制了几种人工皮肤，但目前尚无一种能完全满足创面修复在功能上与外观上的需要，其存在的最大共同问题是均不能重建毛囊、皮脂腺、汗腺等皮肤附属器官，降低了皮肤对环境的适应能力。因此，进行烧/创伤皮肤的功能修复，是目前创伤修复的热点问题，也具有极大的临床应用前景。
组织损伤修复是一个极其复杂的生物学过程，需要有多种细胞、细胞外基质(ECM)成分以及各种调控因子的共同参与。目前认为，参与组织损伤修复的细胞来源主要有两大类：一类是定居于损伤组织自身的干细胞（resident stem cells），其在许多组织中已经被鉴定出来，包括神经〔１〕、脂肪〔２〕和表皮〔３〕等；另一类是由骨髓迁移到损伤组织的骨髓来源细胞（bone marrow derived cells）。归巢到损伤位点的骨髓来源干细胞或分化为损伤细胞的表型〔4,5〕，或通过创造增强修复的微环境来促进组织内源性细胞的再生〔６〕。目前认为，骨髓中至少有两种多能干细胞群可能有助于组织修复，即造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）和间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）。皮肤组织损伤后，在损伤细胞产生的趋化信号作用下，骨髓中的干细胞从骨髓动员到循环细胞池并迁移到损伤位点。在早期炎症阶段，这些细胞调节上皮细胞和真皮MSCs的增殖和迁移〔7〕，促进炎症细胞趋化，发动创伤修复过程；炎症消退后，骨髓来源的细胞可以分化为表皮角质细胞、皮脂腺细胞、毛囊上皮细胞、树突状细胞以及内皮祖细胞，并且可整合到愈合的皮肤〔8,9〕；上皮化完成后，HSCs和MSCs都能产生Ⅰ、Ⅲ型胶原，长期重构愈合的真皮。
1 骨髓MSCs的生物学特性
MSCs是来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中最易获得，胎肝、胎儿脐血中亦可分离得到〔10〕。骨髓中只含有少量MSCs，约占单核细胞的0.001%~0.010%，并随着年龄增加而减少。原代培养的MSCs经过2～4 ｄ潜伏期，迅速集落性扩增，呈旋涡状生长，细胞呈均一的成纤维状形态。MSCs中约有20%的细胞处于静止期（G0期），表明MSCs有强大增殖能力。
MSCs的表面标志具有非单一性特征，它表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，一般认为CD29、CD44、CD166及SH2、SH3是MSCs的重要标志物〔11，12〕，通过流式细胞仪研究细胞表面抗原发现，MSCs分子表面不表达造血细胞表面抗原，如造血前体细胞标志抗原CD34，白细胞标志抗原CD45，淋巴细胞表面抗原CD11α，单核细胞/巨噬细胞表面抗原CD14，证明MSCs为非造血类细胞。
常见培养方法为全血接种法、氯化铵溶血法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法。Vlasselaer等〔13〕的实验表明，利用流式细胞仪分选的细胞，有很多不黏附于培养瓶，且在培养24 ｈ后死亡，推测可能是分选操作抑制了ECM蛋白黏附分子的合成和分选操作中的剪切力所致，称为“分选效应 (sorting effect)”。吕昌伟等〔14〕通过对全血培养法、溶血纯化法、密度梯度离心法进行比较性研究，结果显示在克隆形成率、首次传代时间、扩增成功率等指标方面，密度梯度离心法明显优于其他两种分离法。
在研究早期人们普遍认为，干细胞只在个体发育时向其最为相邻的细胞形态增殖，这一传统观念在过去10年的研究中被彻底颠覆。一些成体细胞显示出极为广阔的可塑性，因此，在临床应用中有着向多种组织分化的能力，这种可塑性是一把双刃剑，不稳定的细胞表型可以导致组织细胞功能和/或表型的退化，甚至分化为恶性细胞。成体干细胞的可塑性是指来源于一种器官或组织的干细胞被转移到另一种生长环境中，分化成与新的生长环境相适应的细胞。大多数人认为干细胞的分化与微环境密切相关，干细胞进入新环境后对新的微环境调节信号作出反应。
MSCs连续传代和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，体外培养12代仍能保持正常的染色体组型和端粒酶活性〔11〕。在一定的诱导条件下，如微环境中的细胞因子、多维分化信号、ECM成分以及同种或异种细胞间接触等，MSCs具有向成骨细胞、软骨细胞、 肌腱细胞、脂肪细胞〔15〕，骨骼肌、平滑肌、造血支持基质〔16,17〕等中胚层细胞分化的能力；同时可以向外胚层的星形胶质细胞〔18〕，神经元〔19,20〕，表皮或上皮组织〔21〕及内胚层的肝卵圆细胞〔22〕、血管内皮细胞〔23〕和心肌细胞〔24〕分化。
2 骨髓HSCs的生物学特性
HSCs是较早进行研究的干细胞，1962年Goodman等首先实验证明小鼠血液中存在HSCs。HSCs由胚胎期的中胚层细胞衍生而来,在卵黄囊、胎肝和骨髓中可分离得到。出生后HSCs包括骨髓干细胞和外周血干细胞。 HSCs 约为整个骨髓细胞的0.01%～0.05%，体积较小，体积质量较轻，形态与小淋巴细胞相似；对4 氢过氧环磷酰胺(4 HC)和5 氟脲嘧啶(5 FU)有抵抗作用；罗丹明拒染或淡染。HSCs可持续产生并且维持终生，具有自我更新和多向分化增殖潜能，99.5%以上处于G0期。HSCs是体内各种血细胞的惟一来源，单个HSCs就可以重建整个造血系统所有髓系和淋巴系细胞。
已有研究显示，HSCs的表型特征为CD34+/Thy1+/CD38/Lin－/CD45RA+/Rh123dull。国内外研究都支持CD34+是HSCs的主要标志物。但最近的研究发现，还存在着CD34－HSCs，它能长期重建造血系统，并且可以分化为CD34+细胞。Ziegler等〔25〕报道，血管内皮生长因子受体(KDR)可作为判别HSCs和造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells,HPCs)的标志。KDR+在CD34+细胞表达仅占0.1%～0.5%，HSCs细胞表面标志限定在CD34+KDR+，而HPCs细胞表面标志则为CD34+KDR－。Nishi等〔26〕报告，CD34－Lin－CKit+Scal+的部分HSCs具有长期重建造血的能力，因此,CD34+CD38－Lin－CKit+Scal+的细胞都是HSCs。
获取高度均一的纯化细胞是开展细胞生物学特性等各项研究的基础。最近20年来建立的HSCs分选方法主要有流式细胞分选技术(FACS)、组织培养瓶铺展贴壁、亲和吸附柱(CEPRATE)、免疫磁珠法（MACS）等。但前3种方法存在纯度不高、技术要求高、仪器设备昂贵、影响细胞活力、易于污染等不足。免疫磁珠是一种包被有单克隆抗体的磁性微粒，可特异性地与靶物质(细胞、蛋白质、DNA和细菌等)结合，使之具有磁顺应性，继而在外加磁场的作用下被滞留，从而与其他成分分离，达到富集纯化的目的。MACS根据最终选留物质的不同可分为阳性选择(留取与磁珠结合的阳性物质)和阴性选择(留取不与磁珠结合的阴性物质)。
早期干细胞研究主要集中在HSCs上，且在HSCs移植及基因治疗血液病方面取得了巨大进展。单个HSCs可重建整个造血系统所有髓系和淋巴系细胞。现代干细胞技术研究表明，HSCs较预期有更高的可塑性，可分化成为除造血组织外其他类型的组织细胞。Ohgushi等〔27〕研究发现，用HSCs依附在生物活性材料上，扩增后植入皮下、肌肉或骨缺损处，在微环境作用下，可以向特定的方向转化，成为其他类型的细胞。Eglitis等〔28〕研究表明，HSCs能够分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞及小胶质细胞。Jackson等〔29〕发现，移植后HSCs可选择性自行迁移进入受体小鼠心肌梗死灶内，进一步分化形成心肌细胞和血管内皮细胞,参与形成有功能的心肌组织。Alison等〔30〕研究指出，骨髓干细胞或HSCs能够在鼠肝内转化成为肝卵圆细胞，甚至成熟的肝细胞和胆管细胞。
3 骨髓细胞对创伤皮肤软组织细胞的修复
骨髓细胞长久以来被认为是通过产生炎性细胞分泌的细胞活性因子及其相应的级联反应来参与皮肤损伤的修复。近年来研究表明，骨髓细胞也可以成为皮肤祖细胞一个重要补充源。目前在皮肤创伤修复的研究中常引入GFP转基因小鼠模型（green fluorescent protein transgenic mice），其骨髓细胞中约有一半的细胞带有绿色荧光标记，在荧光显微镜的特定波长下可以显示绿色荧光。Kataoka等〔31〕和Fathke等〔32〕将从GFP鼠股骨中获取的骨髓细胞注入到非GFP鼠体内，受体鼠在移植前要经过放射线如60Co或化疗药物如白消安等的处理，以破坏其免疫系统，防止移植排斥反应的发生；在移植后10周，免疫荧光显微镜下可观察到正常皮肤中有散在的绿色荧光标记；流式细胞技术检测到GFP阳性细胞约占皮肤中正常皮肤细胞的14%，GFP阳性细胞在非创伤表皮中发生浸润，在临近表皮的毛囊、内外毛根鞘局部、真皮乳头和邻近毛囊膨出部可见到很多GFP阳性细胞表达，但在皮脂腺和汗腺周围很少看到。在GFP嵌合体鼠的背部形成深达筋膜的创面，观察骨髓细胞对创面愈合和皮肤再生的促进作用，结果发现，创伤后21 d，创面已达到完全上皮化。在新生成的血管、毛囊、真皮的横纹肌、皮脂腺和表皮中可以明显看到GFP阳性细胞，其中毛囊和皮脂腺中表达较高。同时对创面再生皮肤进行特异性免疫染色，发现GFP阳性细胞可以出现角蛋白和GFP抗体双重标志。这一发现强有力地证明了骨髓在皮肤组织损伤时有向表皮干细胞或祖细胞转化的趋势。 Badiavas等〔33〕在实验中将GFP骨髓细胞与C57BL胎鼠的真皮细胞和表皮细胞按比例混合涂抹到裸鼠背部创面，并用一个特制的硅胶帽罩住周边创面边缘，防止其在创伤愈合期间向创面蔓延生长。在创伤4周后，在创面形成与C57BL鼠相似的黑毛，提示重建的皮肤组织是由移植的细胞组成，而不是由宿主周边的残余皮肤细胞移行而来。在移植3周后重建皮肤的组织切片中，发现许多GFP阳性细胞出现在表皮、毛囊、皮脂腺和真皮中。在重建的组织中约有372个毛囊，其中18个（占48%）含有GFP阳性细胞。在这些含有GFP阳性细胞的毛囊中GFP阳性细胞大约占细胞总数的10%～90%，一些毛囊主要由GFP阳性细胞组成。在87个再生皮脂腺中有10个表达GFP阳性细胞，其腺体中的阳性表达率占25％～90%。为了标记这些从骨髓细胞衍生的皮肤细胞，研究中采取了组化和特殊染色。结果发现，表皮基部和底部皮脂腺的GFP阳性细胞表达CK1（一种表皮及其相关细胞典型的角蛋白标志物），在毛囊外根鞘的GFP阳性细胞表达CK6，在真皮中未发现GFP阳性黑色素细胞。一些GFP阳性细胞形成一个环形结构，其内出现红细胞，这些细胞表达血管假血友病因子，这种因子是从表达有平滑肌肌动蛋白的细胞中分离得到的，提示这是新生的血管管腔。在表皮中同时还发现了树突状GFP阳性细胞。这一实验表明骨髓来源的细胞可以分化为组成皮肤组织的各种细胞。
4 MSCs对创伤皮肤软组织细胞的修复
当前，有关HSCs对皮肤创面软组织细胞修复的研究鲜有报道。相反，近期Rovo等〔34〕 的研究却表明移入体内的HSCs并不能达到毛囊的重建。因此我们猜想在骨髓细胞中参与创伤皮肤软组织细胞重建的主要是MSCs，并有望利用干细胞壁龛（niche）诱导MSCs分化来重建皮肤附属器官〔35〕。当前国内对于该项的研究常采用MSCs体外培养标记，体内移植转化的方法进行观察。将获取的成体大鼠骨髓细胞在体外进行培养，传至第3代，移植前用5 μmol/L的5溴脱氧尿嘧啶（5 BrdU）的培养基孵育。应用5 BrdU标记细胞是目前细胞生物学研究手段中的一项基本技术，在细胞合成期(Ｓ期)5 BrdU替代胸腺嘧啶掺入细胞核内，可以作为体外培养的MSCs所特有的标记物，以区分在体细胞。将标记好的MSCs注入到烧/创伤动物体内，一般在移植3周后，通过对创面组织的特异性组化染色显示，BrdU阳性细胞多聚集在真皮层及皮下脂肪层的血管周围，部分细胞包绕血管或位于血管内皮处。部分阳性细胞同时表达Ⅷ因子，提示该细胞已转化为血管内皮细胞。有少量5 BrdU染色阳性细胞存在于表皮层。连续切片中5 BrdU阳性细胞同时表达角蛋白,并位于毛囊内层的上皮根鞘、表皮棘层和颗粒层内，呈立方形或多角形，与周围表皮细胞无形态学差异，可见其相邻生长。激光共聚焦显微镜观察，皮肤5 BrdU和角蛋白免疫荧光双染色也有类似结果显示。在一些实验中也初步观察到5 BrdU阳性细胞参与了皮脂腺导管的构成。
目前认为，局部应用MSCs治疗促进皮肤创面愈合，提高愈合质量可能通过以下几种途径：①MSCs分泌的细胞因子和生长因子促进创面肉芽组织的形成、再上皮化及附件的再生。已有研究表明，在创伤环境下MSCs还能够分泌集落细胞刺激因子（G CSF）、白细胞介素6(IL 6)、IL 8、肿瘤坏死因子 α(TNF α)等,影响创伤愈合的过程〔36〕。②MSCs转化为血管内皮细胞、表皮细胞及皮肤附件的某些结构参与修复。
目前,国内外对于皮肤创伤修复的研究虽然取得了一些进展，但均未解决汗腺损伤的修复问题。如果这一问题不能得到进一步解决，就不可能达到再生皮肤的完全功能修复目的。本实验室在利用MSCs对创伤修复取得了一些进展〔21，23，37〕，希望以此来推动创伤皮肤功能修复的进一步完善。李海红等〔38〕体外分别分离培养和扩增人骨髓MSCs和人汗腺细胞（SGCs），用二步免疫细胞化学法检测骨髓MSCs和SGCs抗原表达情况。SGCs经高温损伤后，大多数细胞的细胞间连接消失。与经5BrdU标记的MSCs共同培养2周后，部分细胞同时表达癌胚抗原(CEA)和BrdU，并且有多核现象。细胞染色显示双染细胞可达1%～5%，多核细胞且核染色不同的细胞约为0.01%～0.05%。通过以上实验我们认为，在损伤的微环境下，MSCs可以向SGCs转化，其机制可能是细胞分化、细胞融合甚至是核融合。
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基金项目：国家重点基础研究发展规划基金资助项目（2005CB522603）；国家自然科学基金资助项目（30230370，30500194）
作者单位：100037北京，解放军总医院第一附属医院（原解放军第三○四医院）全军创伤修复重点实验室（王君，李海红，付小兵）；010059呼和浩特，内蒙古医学院（王君，李存保）
通讯作者：付小兵，博士(西班牙)，博士研究生导师，研究员
作者简介：王君，男，内蒙古呼和浩特人，硕士研究生。 |
