夏浩(综述) 梁华平 顾红光(审校)
【关键词】 内毒素耐受;核转录因子κB;内毒素;信号转导
内毒素多次刺激单核/巨噬细胞后可产生内毒素耐受现象,其机制主要为内毒素信号转导功能障碍导致核转录因子κB(NFκB)转位受损。创伤、脓毒症、内毒素血症和全身炎症反应综合征（SIRS）患者均具有内毒素耐受特征，内毒素耐受现象应用于临床可能会降低脓毒症和SIRS患者的病死率。
1 内毒素耐受的概念
细菌内毒素是许多炎症因子的有效激活物，也是引起严重脓毒症的主要介导物，能介导多种细胞（单核/巨噬细胞、枯否细胞等）炎症介质的释放，参与机体免疫炎症反应，严重时可致脓毒性休克，甚至多器官功能障碍综合征（MODS）〔1〕。预先以小剂量内毒素或其同系物刺激动物巨噬细胞，而后再用致死剂量攻击，可引起细胞因子释放大幅度减少或不分泌，以保护机体免受内毒素致死性毒性反应，此即内毒素耐受。内毒素耐受是机体通过改变炎症介质的释放，对内毒素产生低反应性的一种保护状态〔2〕，也是对抗致死性严重脓毒症高度有效的保护机制。宿主的免疫细胞，尤其是单核/巨噬细胞，在暴露于内毒素3～24 h后再给予内毒素刺激即产生耐受，并表现出与内毒素刺激有关的一系列复杂应答变化。内毒素耐受现象表现为内毒素刺激后效应细胞中细胞因子释放改变；丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导途径抑制；NFκB活化障碍。
2 内毒素耐受的体外模型
细胞LPS预刺激剂量预刺激时间LPS刺激剂量刺激时间单核细胞系(Mono Mac 6)20.0 μg/L2~3 d1.0 mg/L4 h鼠腹膜巨噬细胞100.0 μg/L24 h100.0 μg/L24 h人脐静脉内皮细胞(HUVEC)0.5 mg/L24 h0.5 mg/L4 h人B细胞系(RPMI8226)50.0~250.0 μg/L3~4 d1.0 mg/L6~24 h人促单核细胞株(THP1)10.0 μg/L24 h1.0 mg/L6 h人肠微血管内皮细胞(HIMEC)0.5 mg/L24或48 h1.0 mg/L2 h外周血单个核细胞(PBMC)1.0或100.0 μg/L24 h100.0 μg/L24 h2内毒素耐受的模型
迄今为止，已建立了多种内毒素耐受模型，分体内模型和体外模型两类，具体模型见表1和表2。
3 内毒素耐受的机制
内毒素耐受现象已被广泛研究〔３〕，但到目前为止其分子机制还不明确。作为主要LPS受体的Toll样受体(TLR)家族及其他细菌产物的发现引起了大家研究内毒素耐受的兴趣。研究发现，LPS刺激5 h内TLR2和TLR4的基因表达提高，从而提高了机体对LPS等病原体模式识别分子的反应性〔４〕。LPS可启动单核/巨噬细胞内多个信号转导的级联反应，其机制主要为关键信号转导途径中一些特定环节的反应因子表达下调或功能障碍。
3.1 TLR的作用：TLR4是转导LPS信号的主要跨膜受体，LPS膜受体复合物由两个相互作用的受体CD14、TLR4及相关蛋白髓样分化蛋白2(MD2)组成，且TLR4可能是协同CD14共同介导LPS信号转导的跨膜分子。LPS或含有LPS的颗粒通过血浆中的脂多糖结合蛋白(LBP)与单核/巨噬细胞表面的CD14和TLR4结合。由于CD14无跨膜区和胞内区,TLR4就成为介导LPS信号由胞外向胞内传递的跨膜信号转导受体。而内毒素耐受同细胞膜TLR4、MD2复合物表达下调密切相关〔5〕，此观点已得到证实〔6，7〕。但也有研究发现，LPS刺激后，肝窦内皮细胞表面TLR4表达并未改变，从而也就不能解释内毒素耐受的机制〔8〕。
TLR家族另一受体TLR2与TLR4相反，其在耐受细胞表面的表达上调，且单核细胞白细胞介素1受体相关激酶1(IRAK1)mRNA表达和蛋白质表达受抑，其机制主要依赖于TLR2〔9〕。Sato等〔10〕发现，鼠TLR2和TLR4均能识别巨噬细胞活化脂肽（MALP2）及LPS，用MALP2和LPS共同刺激鼠腹膜巨噬细胞引起肿瘤坏死因子α(TNFα)分泌显著增多，提示TLR2和TLR4介导信号途径的协同作用。
此外，内毒素耐受时花生四烯酸代谢下调是由G蛋白介导的，与细胞膜G蛋白的含量及活性降低有关，引起G蛋白对受体介导的信号反应低下而处于失活状态〔11〕。
3.2 细胞内信号转导功能障碍：IRAK是细胞内信号转导激酶和LPSTLR4信号转导途径中的重要环节，在内毒素耐受细胞中，其表达水平下调且呈失活状态。在革兰阴性细菌感染中，用LPS刺激后，此复合物通过转导一种可被TLR4髓样分化因子88（MyD88）识别，并通过IRAKs、肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF6)以及NFκB诱导激酶(NIK)级联反应向前传递的信号，最终导致NFκB的活化〔12〕。初次LPS刺激后，可观察到IRAK活性增加、MyD88与IRAK迅速结合及NFκB活化，相反，在内毒素耐受单核细胞，IRAK表达显著下降而且酶学活性消失，MyD88表达下调且IRAK/MyD88结合被抑制，无法继续转导LPS的跨膜信号，因此，IRAK可下调内毒素耐受细胞中LPS的激活效应〔13，14〕。AdibConquy等〔13〕发现，用γ干扰素(IFNγ)或粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)预处理单核细胞，IRAK表达上调，可见IFNγ和GMCSF阻止耐受的机制可能是抑制IRAK降解及促进其与MyD88结合，引起NFκB活化和TNF产生。
内毒素耐受还与MAPK活性降低相关〔15〕，LPS可激活包括胞外信号调节激酶(ERK)、cJun基因氨基末端激酶(JNK)和p38在内的不同MAPK反应激酶途径级联反应，促使其下游分子的丝氨酸/苏氨酸发生磷酸化。Tominaga等〔16〕发现，LPS刺激内毒素耐受的小鼠巨噬细胞后，ERK、JNK和p38激酶的磷酸化程度明显减弱甚至消失，且ERK级联反应的上游信号转导部位或膜受体活化受抑，使内毒素信号传递障碍。
3.3 NFκB活化障碍：NFκB是一个多功能的核转录因子，其与炎症性疾病密切相关。其N端含有的Rel结构域（relhomology domain,RHD），包括与其他Rel蛋白、DNA和NFκB抑制蛋白(IκB)结合的区域以及核转位序列（nuclear localization sequence,NLS）,其C端含有反式激活结构域。NFκB是由两个Rel家族蛋白构成的二聚体，如有转录活性的p50/RelA和无转录活性的p50/p50。NFκB与抑制性IκB结合，存在于细胞质内。当细胞初次接触内毒素后，不仅MAPK磷酸化，IκB也迅速被IκB激酶(IKK)磷酸化并降解，与NFκB解离，NFκB活化并转位入胞核与相应DNA区域结合，调控基因表达与介导炎性介质产生〔1719〕。研究证实,内毒素耐受细胞再次受到LPS刺激后，NFκB仍可转移到细胞核内,但其亚单位复合物从p50/p65异二聚体变为以p50/p50同二聚体为主，后者虽可与目的基因结合,但却不能反式激活目的基因表达,反而抑制了其基因表达〔2022〕。Chan等〔23〕研究发现，LPS致敏THP1的NFκB在细胞质活化和核内反式激活阶段,均出现p65聚集并与白细胞介素1β(IL1β)启动子结合的现象，而内毒素耐受THP1细胞的NFκB p65却不与IL1β启动子结合；相反，同样在细胞核内聚集的NFκB p50无论在内毒素效应细胞还是内毒素耐受细胞中均与启动子IL1β结合。也有人发现，内毒素耐受细胞的IKK不能被激活，导致IκB无法降解，持续与NFκB结合，从而抑制NFκB活化〔24〕。另有报道，脂肪细胞的一种主要产物可介导NFκB的核转位，但当其预刺激人单核细胞后，再次用其他促炎刺激如LPS时可诱导细胞对促炎刺激产生耐受，使NFκB活化受阻从而发挥抗炎效应〔25〕。
此外,LPS通过引起内源性糖皮质激素释放,抑制促炎因子基因逆转录。糖皮质激素可能参与了内毒素耐受的发生机制〔26〕。因此,内毒素耐受与感染和炎症反应密切相关。总之，内毒素耐受受到多种膜分子和信号转导分子的调控，其机制还未完全阐明。目前研究较多的是NFκB和TLR4，但对内毒素耐受这一状态及其建立过程的研究仍较少，复杂的体内环境也给研究带来了困难。
4 内毒素交叉耐受现象
采用合成的细菌脂肽预处理人的THP1单核细胞，当再次用细菌脂蛋白（BLP）刺激后，发现无TNFα和IL6产生，称为BLP耐受。发生BLP耐受的THP1细胞不再对LPS刺激产生应答，此即内毒素交叉耐受现象〔27〕。内毒素耐受抑制单核/巨噬细胞炎症介质的产生，其他因素如TNFα和IL1β的刺激也有上述现象。研究发现，在LPS、IL1β和TNFα刺激后发生多种信号转导途径受体后汇聚的现象，所以可以假设这些刺激中有共同信号分子下调从而引起交叉耐受,IL1β不需抑制LPS诱导活化的MAPK和NFκB，从而导致LPS诱导介质产物引起交叉耐受现象〔17〕。而用TNF刺激内毒素耐受细胞，可激活IKK，所以内毒素耐受细胞并未对TNF产生交叉耐受〔28〕。
5 内毒素耐受的临床意义
内毒素耐受是机体的一种自我保护机制。内毒素耐受时，机体能抵抗大剂量或致死量LPS的毒性作用，因而有作者提出将其作为预防性治疗，以降低可能发生的革兰阴性杆菌感染和内毒素血症的死亡率。内毒素耐受在抑制促炎细胞因子分泌的同时,明显上调抗炎介质的释放,可以防止内毒素血症诱发的促炎介质和化学因子释放及氧自由基损伤,以及减轻重要器官的损伤,对于防止过度炎症反应引起的组织和器官损伤以及脓毒性休克的防治有重要意义〔29〕。有人提出使用无毒性的LPS类似物，如单磷酰磷脂A诱发内毒素耐受,可以降低患者血浆TNFα水平,减轻或预防内毒素引起的并发症〔30〕。
创伤可致内毒素耐受,重度创伤能降低外周血单核细胞对LPS的反应性,使促炎性细胞因子分泌减少〔31〕。IFNγ 或GMCSF通过活化蛋白激酶C途径增加细胞因子生成量,提示信号转导障碍是创伤时内毒素耐受的主要原因〔13〕。
虽然有资料表明TNF等促炎细胞因子在SIRS及脓毒症的发病过程中具有重要作用,但临床上针对TNF等的靶向治疗并未取得很好的效果〔32〕。研究发现,脓毒症在LPS刺激后存在内毒素耐受现象〔33〕,并且血清TNF的低水平表达与脓毒症患者较差的临床预后呈正相关〔34〕,创伤和SIRS患者的单核细胞TNFα生成量显著高于脓毒症患者,提示LPS刺激后单核细胞促炎细胞因子生成量可作为观察脓毒症患者预后的参考指标。有研究结果证明,SIRS患者外周血单核细胞的NFκB为无活性的p50/p50同二聚体,与内毒素耐受细胞的NFκB表达形式相同〔35〕。
总之，内毒素耐受现象有望应用于临床以减轻革兰阴性杆菌脓毒症等严重内毒素血症引起的系统性炎症反应及组织和脏器功能损伤。从细胞信号转导和基因转录调控水平认识LPS激活单核/巨噬细胞并诱导耐受的分子调节机制,可为从分子水平干预LPS诱导的炎症和损伤效应提供新的靶点和治疗措施,如对严重脓毒症患者通过抑制NFκB活化〔36〕或抑制IκB降解〔37〕以达到治疗的目的,这对于创伤、感染和多器官功能衰竭的研究具有重要意义。
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基金项目：国家“973”重点基础研究基金资助项目（2005CB522602）
作者单位：400042重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所肝胆外科(夏浩，顾红光)，一室(梁华平)
作者简介：夏浩，男，硕士研究生，研究方向为肝胆疾病、炎症和创伤。 |
