高冬娜(综述) 张或（审校）
【关键词】肺损伤，急性；急性呼吸窘迫综合征；中性粒细胞弹性蛋白酶
急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是机体遭受严重创伤、休克、酸中毒及严重感染，如严重急性呼吸综合征（SARS）等因素引起的继发性弥漫性肺实质损伤，临床表现为呼吸窘迫和顽固性低氧血症〔14〕。目前认为，ALI/ARDS发病的根本原因是肺内过度、失控的炎性反应。ALI和ARDS同属急性呼吸衰竭(ARF)范畴，是临床常见呼吸系统急危重症，其病因及发病机制错综复杂，致病环节多，病死率高，已成为临床危重病学研究的热点和难点。
中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）是引起ALI炎症级联反应的终效应因子〔5〕，主要是通过损伤毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞、消化和降解细胞外基质(ECM)以及上皮连接结构，参与和启动ALI的发生。现将NE在ALI发病中的作用及治疗对策综述如下。
1 NE的生物学特性
1.1 NE的生物学效应：NE是含218个氨基酸残基和4个二硫键的单链糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶超家族，主要来源于中性粒细胞(PMN)，在单核细胞、T细胞和肥大细胞中少量存在〔6〕。生理情况下，NE被储存于细胞的嗜天青颗粒中或表达于被细胞因子初次激活的细胞表面。其基因由50 kb构成，定位于人19号染色体短臂末端，该基因的高水平转录只限于早幼粒细胞阶段。NE空间结构中含有一个由3个氨基酸残基（组氨酸41，天冬氨酸88，丝氨酸173）构成的保守活性中心，此区域的丝氨酸具有高度的亲核特性，并且对低电荷的氨基酸具有高度的亲合性〔7〕。当细胞活化、呼吸爆发及细胞裂解时，NE迅速释放到细胞外，其活性受到多种内源性弹性蛋白酶抑制剂的调控。
1. 2 NE的生物学效应归纳起来有以下几方面。
1.2.1 NE是最具破坏性的酶类之一，可降解多种蛋白，约占全部蛋白水解酶总水解活力的80%。生理情况下，主要参与对革兰阴性(G－）杆菌的杀灭作用，构成机体防御体系的重要一环。炎症情况下，炎性细胞活化、呼吸爆发及细胞裂解时释放的NE可降解ECM成分，如弹性蛋白、胶原蛋白、纤维连结蛋白等。除此之外，NE可降解肺泡表面活性物质(PS)及可溶性血浆蛋白，如凝血因子、补体因子及免疫球蛋白等。
1.2.2 NE诱导内皮细胞产生的趋化性细胞因子，如白细胞介素8(IL8)以及NE分解蛋白形成的片段（纤维蛋白和层黏蛋白的片段）对PMN具有趋化和激活作用〔8〕。
1.2.3 NE上调血管内皮细胞黏附分子1（VCAM1）及细胞间黏附分子1（ICAM1）的表达，促进PMN与内皮细胞黏附〔9〕；NE与整合素C3R（CD11b/CD18,Mac1,aMb2）相结合，可降解ICAM1，促进炎性细胞迁移。
1.2.4 NE可诱导上皮细胞释放多种促炎细胞因子，如粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、IL6、IL8、转化生长因子(TGFβ)，引起激肽释放酶原、纤维酶原、高分子激肽原、H因子等分解而形成活化产物，放大炎症反应强度。NE可通过影响PMN的黏附和迁移及降解多种前炎症细胞因子，如IL1、肿瘤坏死因子(TNF)、IL2、IL6及可溶性补体受体，抑制炎症反应进程〔10〕。NE可削弱T细胞的黏附及迁移，抑制其功能，影响机体免疫，调控炎症反应〔7〕。
1.2.5 NE是一种潜在的黏液腺细胞和杯状细胞的黏液促分泌剂，能增加黏蛋白合成及黏液分泌。
2 内源性弹性蛋白酶抑制剂
体液中含有多种高浓度的蛋白酶抑制剂，如α1蛋白酶抑制剂(α1Pi)、α2巨球蛋白(α2M）、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)、特异性蛋白酶抑制剂（Elafin，ESI）、α1抗糜蛋白酶（α1ACT）以及金属蛋白酶抑制物(TIMP)等〔6,11〕。α1Pi是人血浆中最主要的蛋白酶抑制因子，主要由肝细胞合成，肺内的肺泡巨噬细胞及上皮细胞亦有少量合成，主要定居于下呼吸道，发挥92%抗NE的作用。α2M由肝脏的淋巴细胞、单核细胞及纤维母细胞合成和释放，亦存在于血浆中，对NE具有持续性抑制作用，反应的同时被NE灭活〔6〕。SLPI是一种嗜中性弹性蛋白酶阳离子抑制剂,为黏膜分泌的非糖基化单链多肽蛋白，SLPI来源于肺、皮肤及其他器官的上皮细胞、PMN、肥大细胞及巨噬细胞。人类SLPI的免疫组化定位研究显示，其定居于皮肤、上呼吸道、唾液腺、生殖腺和泪腺。在肺内，SLPI主要由黏膜表面上皮细胞、Ⅱ型肺泡细胞、单核细胞、肺泡巨噬细胞和PMN合成，在呼吸道上皮表面发挥抗NE作用，同时SLPI还具有抗菌、抗病毒、抗炎特性。Elafin又被称为弹性蛋白酶特异性抑制因子(elastasespecific inhibitor)，在呼吸道，Elafin主要由肺泡上皮细胞、Clara细胞及肺泡巨噬细胞在炎性刺激诱导下表达，与SLPI具有40%的同源性〔12〕。新近研究表明，Elafin对肺部炎性细胞具有趋化作用〔13〕。SLPI及ESI均为低分子质量蛋白酶抑制剂，同属抗白细胞蛋白酶家族成员。研究表明，SLPI及ESI是肺内重要的蛋白酶抑制剂，构成重要的抗蛋白酶保护屏障，在对抗NE介导的肺损伤中起重要作用。
3 NE与ALI/ARDS
3.1 NE在ALI/ARDS发病机制中的作用：研究表明，NE在ALI/ARDS的发病过程中起重要作用。支持这种观点的事实有：①ALI/ARDS患者及动物模型的血清及支气管肺泡灌洗液（BALF）中NE含量及活性增加；②在体内、外应用NE可产生典型的ALI症状；③预先用NE抑制剂处理可降低ALI/ARDS动物模型复制的成功率；④应用NE抑制剂可减轻ALI/ARDS患者及实验动物的症状。目前NE在ALI中的作用机制尚不清楚，考虑与以下几方面有关（图1）。
3.1.1 蛋白酶抗蛋白酶的失衡：内源性弹性蛋白酶抑制剂的生理功能是提供一种抗NE的保护屏障，以防过量NE对宿主组织的损伤。蛋白酶抗蛋白酶的平衡对维护肺组织稳定性起到重要作用。目前研究表明，NE在炎症部位能够逃逸内源性弹性蛋白酶抑制剂对其多方面的调控，使肺内NE持续具有活性，其机制主要有以下几方面：①由于立体结构的限制，分子质量高的蛋白酶抑制剂(α1Pi,α2M)无法进入NE与其底物组之间的微环境发挥效力〔14〕；②血循环中，NE与α1Pi以1∶1或1∶2的比例结合形成NEα1Pi复合物而使α1Pi失去活性〔15〕；③体内重要的蛋白酶抑制剂α1Pi、SLPI及ESI可被PMN的活性氧产物灭活〔7〕，如PMN释放的ROS可使α1Pi活性中心蛋氨酸残基氧化失活〔16〕；④NE可降低SLPI的分泌量；⑤内源性弹性蛋白酶抑制剂对与组织结合的NE并非完全有效。另外，多种细胞因子以及化学趋化因子，如TNFα、IL8、C5a等均可促进PMN释放NE。这些机制可破坏NE和内源性弹性蛋白酶抑制剂之间的平衡，引起肺组织过度损伤。
3.1.2 降解组织蛋白、放大炎症反应：生理情况下，NE主要参与对致病微生物的杀灭作用，构成机体防御体系的重要一环〔6〕。炎症情况下，炎性细胞活化、呼吸爆发及细胞裂解时，通过降解结缔组织蛋白可引起无法修复的组织损伤。NE可降解ECM，其最适底物弹性蛋白是气血屏障的主要成分，占人肺干重的20%〔7〕，NE对其具有特异的水解作用。NE可降解纤维粘连蛋白，增强病原菌与气道上皮细胞的黏附力，导致感染的发生和不易控制。NE通过降解ECM导致血管内皮细胞及肺泡上皮细胞损伤，肺通透性增加，出现非心源性肺水肿伴PMN大量浸润。PMN激活后进一步释放NE形成恶性循环，加重肺损伤；同时激活的PMN可通过呼吸爆发释放大量ROS细胞膜、DNA、蛋白质、酶及受体，从而直接造成细胞损伤及死亡〔17〕。NE可降解PS，干扰人体防御反应和肺舒缩功能，影响肺组织顺应性〔9〕。
严重感染是导致ALI/ARDS的常见病因。近来的研究提示，感染、炎症和酶这些因素相互作用，形成一个破坏支气管肺组织的恶性循环。表面活化蛋白D(SPD)特异性作用于PMN，在防御细菌、真菌、呼吸道病毒感染的先天免疫中极为重要。而NE可裂解SPD，破坏其生物学功能，促进感染进展。另外，NE可引起免疫球蛋白、C3bi及细菌蛋白的降解，降低人体对病菌的清除率，增加细菌感染的机会。
NE可激活前明胶酶原（一种金属蛋白酶原降解胶原蛋白），破坏血管内皮细胞基膜及内皮上皮细胞间紧密连结，利于炎症细胞向组织浸润〔7〕；NE具有前炎症因子效应，它可诱导上皮细胞释放GMCSF、IL6及IL8，进一步激活单核/巨噬细胞、淋巴细胞、PMN等活性细胞，形成细胞因子复杂网络，并相互作用，产生细胞因子的“级联瀑布”效应，放大炎症反应。
NE上调核转录因子κB（NFκB）和激活因子蛋白1(AP1)，诱导IL8表达及合成，IL8的释放量与NE剂量成正相关〔3〕；IL8诱导选择素的表达和脱落，促使PMN的黏附和渗出，导致肺内PMN大量聚集；IL8可趋化和激活PMN，促使PMN脱颗粒和呼吸爆发，释放溶酶体和ROS放大炎症反应。
NE上调细胞黏附分子的表达，促进PMN与内皮细胞黏附；NE与整合素C3R（CD11b/CD18,Mac1,aMb2）结合，降解ICAM1，促进炎性细胞迁移并向肺内浸润，释放炎症介质，激活补体，诱导细胞因子如IL8、粒细胞刺激因子、血小板生长因子B及内皮素等的合成及释放，而这些物质又能吸引和激活PMN释放更多的NE。
3.1.3 影响炎症细胞凋亡：细胞凋亡是炎症反应灶内PMN清除的主要途径。但凋亡延迟时，细胞容易出现坏死。PMN内含有的大量酶、ROS及炎症介质外泄，进一步加重了组织损伤。ALI时肺泡内渗出的PMN发生凋亡延迟，流式细胞分析显示，NE裂解巨噬细胞表面磷脂酰丝氨酸受体（PSR）和CD14，特异性地阻断了巨噬细胞对凋亡细胞的识别〔18〕，因此认为，NE通过这一机制使气道内凋亡细胞清除不足，这可能是导致ALI/ARDS持续进展的原因之一。还有研究表明：IL6、IL8及活化的NFκB对PMN凋亡有抑制作用〔19〕。
3.1.4 抑制NE活性可以减轻ALI/ARDS：近十几年来，有许多NE抑制剂被用于动物实验研究，包括ONO6818、EPIHNE4、Sc39026、ONO5046等。这些NE抑制剂被用于治疗内毒素、缺血/再灌注、血栓素和波佛酯等损伤因子引起的不同动物模型ALI中，取得了一致的疗效〔20〕。Kuraki等〔２０〕报道，NE抑制剂ONO6818能够对抗NE引起的ALI。Sivelestat（ONO5046）是一种对NE具有高度专一性的全身性强烈抑制剂，能够减轻内毒素、波佛酯、油酸和再灌注引起的各种动物ALI/ARDS症状。Miyazaki等〔21〕报道NE抑制剂ONO5046能对抗TNFα所致ALI/ARDS。ARDS的病程与BALF内NE含量相关，Sivelestat可减轻实验动物ALI的程度，降低死亡率〔22〕。Hagio等〔２３〕的研究发现，Sivelestat 30 mg•kg－１•h－１可抑制由波佛酯（40 μg/kg）处理雄性白兔BALF中90%的NE活性。目前，Sivelestat在日本已被批准在临床使用，是第1个针对全身炎症反应综合征（SIRS）研究成功并进入临床的药物〔24〕。2003年在我国SARS流行期间已有应用〔25〕。临床实验证实，本品通过抑制PMN释放NE，改善伴有SIRS的ALI患者呼吸功能，缩短患者呼吸机使用时间，使患者尽早脱离危险期，降低死亡率。
目前国外研究表明，ALI/ARDS患者血浆和BALF中NE含量和活性明显增高，并在ALI/ARDS的病理生理过程中起重要作用，且NE抑制剂已进入临床试验阶段。因此，深入研究NE在ALI中的作用机制，将进一步推动国内有关ALI/ARDS研究和临床工作的开展。
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基金项目：辽宁省大连市科技计划项目资助(2003B2NS214)
作者单位：116022辽宁，大连医科大学附属第一医院
作者简介：高冬娜，女，辽宁大连人，硕士研究生。 |
